兩種實驗優化方法的比較研究:在制備薄荷油-β-環糊精包合物過程中的應用

郝吉福，李菲，王建筑，郭豐廣，孔志峰，彭新生

(1.山東泰山醫學院藥學院，山東泰安271016;2.廣東醫學院，廣東東莞523008)

處方設計是藥劑學的重要研究內容之一，在工藝優化和處方篩選過程中，常需要同時考察不同因素、不同水平對結果的影響，并對結果進行優化。而優化設計的目的是進行相互制約特性的有效協調，既能獲得最佳處方設計要求又能在一定的限制條件下制成制劑。從數學和工程設計角度，處方設計可以概括為一個復雜的多因素、多水平、多目標同時優化問題［1］。目前國內應用較多的統計學實驗設計方法主要有正交設計和均勻設計［2］，國外近年來常用集數學和統計學方法于一體的效應面優化法response surface methodology，RSM進行優化［3］。

效應面優化法［4］是采用多元二次回歸方程來擬合因素和響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。具體過程包括實驗、建模、數據分析和最優化。RSM常用的實驗設計方法有星點設計(central composite design，CCD)、Box-Behnken設計(BBD)和Doehlert設計(DM)。

為了客觀地對比正交實驗和BBD實驗優化方法的優勢和差異，本文在優化制備薄荷油-β-環糊精包合物過程中，應用上述兩種統計學優化方法，控制相同的考察范圍(因素、水平)并對優化結果進行了比較，以探討藥劑學研究中對不同優化方法進行合理選擇。

1 儀器與材料

揮發油測定儀(上海玻璃儀器廠);SHZ-E型循環水式真空泵(河南鞏義英峪儀器有限責任公司);HJ-2電動攪拌器(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠);F1004電子分析天平(上海天平廠);薄荷油(安徽太和縣藥用薄荷總廠，批號:20090322);β-環糊精(安徽山河藥用輔料有限公司);其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄荷油-β-環糊精包合物制備

將β-環糊精溶于適量水中，攪拌加熱使其全部溶解，將溶解在少量無水乙醇中的薄荷油緩緩滴入冷卻至設定溫度的β-環糊精水溶液中，維持相應預設溫度下，200 r/min磁力攪拌3～5 h，減壓濾過，分別用蒸餾水和無水乙醇洗滌，將濾渣30℃真空干燥，得到固體包合物。薄荷油-β-環糊精包合物按2010年版《中國藥典》(一部)附錄揮發油測定法測定，其包合率和收率的計算公式為100%

2.2 處方優化設計［5］

在單因素考察實驗的基礎上，選擇對包合物制備工藝影響顯著的3個因素即β-環糊精/薄荷油比例(w/v)(X1)、包合時間(X2)與包合溫度(X3)為因素，以所制備包合物的包合率和收得率為指標，分別采用三因素三水平的正交設計及Box-Behnken設計安排實驗。

2.2.1 正交實驗設計正交設計［6］是利用“正交表”進行科學地安排多因素試驗的設計方法，是從是從全部試驗方案中挑選出代表性強的一部分試驗方案，通過對試驗結果的分析，推斷出相對“最優方案”。具有“均勻分散性、整齊可比性”的特征。但通過正交設計得到的“最優方案”未必是各因素所有水平可能組合中的真正最優結果，有時只說明一個最優的方向，還需要進一步試驗，從而分析各因素對指標的影響大小及變化規律。正交試驗安排及結果見表1。

表1 薄荷油-β-環糊精包合物正交試驗結果

通過直觀分析得出最優的制備工藝條件是:A1B1C2和A2B1C2，綜合方差分析結果及各因素對變量的影響情況，故結合生產實際考慮，選擇條件為A2B1C2即β-CD:揮發油用量比例為8∶1，包合時間為3 h，包合溫度為45℃為最佳制備工藝。

2.2.2 Box-Behnken設計

Box-Behnken［7］實驗設計法是一種基于三水平的二階實驗設計法，可以評價指標和因素間的非線性關系，可以尋找出優化區域，建立優化區域的模型，從而找到響應的優化值。采用BBD這種方法可對包合物制備中各獨立因素及其交互作用對所考察指標(收率與包合率)的影響進行綜合分析，建立數學模型并作出相應的三維應變量曲面圖，對因素與指標的關系進行直觀的量化分析。實驗設計及安排見表2。

按照Box-Behnken實驗設計統計學要求，將因素與響應值進行方程擬合，并以擬合優度(R2)和置信度(P)作為模型判定標準。實驗模型擬合二次多項式方程表達式為:

表2 薄荷油-β-環糊精包合物box-behnken實驗設計結果

圖1 不同因素對響應值(包封率、收率)影響的效應曲面

Y=A0+A1X1+A2X2+A3X3+A4X1X2+A5X2X3+A6X1X3+A7X12+A8X22+A9X32其中Y為響應值(包合率、收得率)，A為方程系數，X為各自變量編碼值。

Y包合率=76.58+3.25X1+0.59X2－1.49X3+2.95 X1X2-7X1X3+1.62X2X3+1.95X12-2.78X22－7.43 X3

2(R2=0.666 9，P=0.286 2＞0.05)

Y收率=78.88-8.47X1+1.13X2+0.63X3+1.77 X1X2－0.98X1X3+6.23X2X3+0.75X12－7.4X22－6.4X32(R2=0.980 8，P＜0.000 1)

從效應曲面圖中可以看出，隨β-環糊精用量與揮發油比例增加時，包合率呈增加趨勢;當包合時間與包合溫度增加時，包合率呈先增加后減少趨勢，意味著在實驗過程中，所選擇的時間與溫度中存在一個極值，通過對效應面的分析能判斷各因素對響應值的影響。但從包合率的回歸方程來看，經F值檢驗顯示方程不顯著(R2=0.666 9，P＞0.05)，說明所選擇的三個因素的不同水平在該范圍內對包合率影響沒有顯著性差異。從收率的回歸方程來看，經F值檢驗顯示方程顯著(R2=0.980 8，P＜0.000 1)，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準確的預測實際情況。隨β-環糊精用量與揮發油比例增加時，收率呈降低趨勢，在包合時間與包合溫度對收率影響過程中，隨兩者增加時，收率呈先增加后減少趨勢，提示在最佳處方附近，效應與因素之間的關系變得非常敏感，實驗條件的微小變化會造成指標的較大改變，效應和因素在此區域內的關系一般表現為非線性;因此可通過預先設定目標對處方進行優化。

在包合物制備過程中，要求所制備包合物的包合率和收率值越大越好，即希望Y包合率與Y包合率存在著極大值;采用Design Expert軟件對處方進行優化，得出最優處方為揮發油:β-CD用量比例為1∶6，包合時間為3.4 h，包合溫度為45.78℃為最佳制備工藝。

通過兩種方法的比較，可以看出正交實驗所需實驗次數少，相對簡單，但當需要控制影響因素微小變化而響應值變化較大時，采用正交實驗產生的偏差較大。與之相對的box-behnken設計通過對效應曲面的分析與評價，更加形象直觀，而且通過統計學分析手段增加了實驗結果的可靠性。因此BBD在實驗條件尋優過程中，可以連續的對實驗的各個水平進行分析，而正交實驗只能對一個個孤立的實驗點進行分析。

2.3 驗證實驗

為了確定建立模型與實驗結果是否相符，通過驗證實驗對模型的可靠性進行檢驗。在驗證實驗中，各因素取值為上述確定的最優條件，分別按照正交設計與box-behnken設計進行驗證性實驗，3批正交實驗結果中收率的結果為82.41%、81.79%、82.16%;包合率結果為85%、85%、87%;box-behnken設計結果收率和包合率其值分別為86.7%、81%，與模型預測值相比較低于3%，證明用兩種方法來尋求薄荷油-β-環糊精包合物最佳制備工藝都是可行的。

3 討論

3.1 國內文獻報道中［8］，揮發油-β-環糊精包合工藝常用正交設計的方法選擇較佳工藝，由于實驗次數少，數據處理和操作都較方便，其應用已達到普及的程度，以正交實驗為例，是基于線性模型設計的方法，影響因素與效應值之間有時可能不是線性關系，若忽略這種情況簡單進行線性模式設計，則會很大程度上與真實值偏離，而Box-behnken設計運用效應曲面模型進行分析，基于非線性模式進行設計和研究，考慮了試驗的隨機誤差，同時將復雜的未知的函數關系在小區域內用簡單的一次或二次多項式模型來擬合。為此BBD對目標值擬和更為精確，響應曲面的描繪細致，適合于當影響因素少許變化時目標值響應特別敏感的非線性部分。

3.2 對各實驗設計的數據處理方法的比較認為:正交設計數據處理由于采用極差分析，通過簡單加合計算即可，最為便利［1］;通過方差分析考察各因素之間是否具有統計學意義。而BBD需進行多元線性回歸求得擬和方程，數學過程略為復雜，通過軟件的輔助處理，使數據處理變得方便，但需要一定的統計學知識作為基礎。

3.3 雖然通過box-behnken設計對目標值的預測能力較強，可以得出最優處方，但如果需要多種因素，會使實驗次數成倍增長，因而在使用響應面優化法之前，應當確定合理的實驗因素與水平，使設計的實驗點包括最佳的實驗條件。再者通過BBD設計所預測出的是一個優化區域范圍，也就意味著在此范圍內的所有因素都可以作為最佳工藝，不具有唯一性。對于如何生成良好的或穩定的設計方案，還不存在通用的基本原則，提示必要時還需與其它設計一起聯合應用，以達到優化設計目的。

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