正交試驗優(yōu)選柘木多糖提取工藝研究

翟延君，伍偉超，王添敏，李波

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600)

柘木為?？浦参镨蠘銫udrania tricuspidata(Carr.)Bur.的干燥根及藤莖，性甘溫，無毒。具清熱、涼血、通絡(luò)之功效，主治婦人崩中血結(jié)，瘧疾［1-2］。現(xiàn)代臨床主要用于腫瘤放、化療輔助藥物，對消化系統(tǒng)腫瘤病人術(shù)后治療療效顯著。目前“柘木糖漿”在臨床上作為抗腫瘤制劑已有使用，該產(chǎn)品對食管、賁門、腸胃等消化系統(tǒng)腫瘤疾病療效顯著［3-4］。文獻(xiàn)報道柘木多糖類成分具有增強(qiáng)免疫力的作用［5］，對其提取工藝的研究尚未見報道。因此實驗采用正交試驗L9(34)，以多糖量為評價指標(biāo)，優(yōu)化柘木多糖的提取工藝［6-9］，為柘木藥材的開發(fā)利用提供理論參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器紫外可見分光光度計(UV24802型)，電子天平(上海天平儀器廠)。

1.2 材料柘木來源于桑科植物柘樹Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur.的干燥根及藤莖。本實驗所用實驗材料采自廣西南寧市郊，由廣西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室廖月葵老師提供并鑒定。

1.3 試劑葡萄糖、濃硫酸、苯酚、95%乙醇、三氯甲烷、正丁醇、丙酮均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置精密稱取干燥至恒重的葡萄糖粉末20.19 mg，至于100 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得濃度為0.201 9 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于6個試管中，加水至2.0 mL，再分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻。室溫放置45 min，在490 nm處測定其吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)(mg/mL)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=21.889C+0.003(r=0.999 5)，結(jié)果表明葡萄糖溶液在0.005～0.025 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.2 柘木多糖的測定精密稱取10.00 g干燥至恒重的柘木粉末(過20目篩)，加入25倍量95%乙醇，水浴回流60 min 2次后，揮干。干燥后的藥材粉末，用25倍量的水在90℃水浴回流提取2 h，濾液sevage法去蛋白(sevage法:多糖溶液加入1/5體積的sevage試劑，強(qiáng)烈振搖。靜置分層，除去交界處變性蛋白，重復(fù)處理9次)，減壓濃縮。向濃縮液加入95%乙醇，至醇體積占總體積的85%，于4℃靜置過夜。抽濾，沉淀經(jīng)95%乙醇、丙酮各洗滌3次，真空干燥，得棕色粉末狀的柘木多糖。粉末置于100 mL量瓶，加水定容，然后吸取1 mL樣品溶液，按2.1.2項顯色測量。

2.2.1 穩(wěn)定性試驗取同一樣品溶液，分別放置0、15、30、60、120 min，按照2.1.2項下顯色，測定吸光度，考察供試品的穩(wěn)定性，結(jié)果RSD為1.22%，在2 h內(nèi)吸收度基本無變化。

2.2.2 精密度試驗另取樣品6份，按照2.1.2項下顯色，測定吸光度，考察方法精密度，結(jié)果顯示精密度RSD為0.32%，符合藥典規(guī)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗取同一批樣品6份，按2.2項下方法提取，然后測定吸光度。結(jié)果測得吸光度的RSD為1.25%，符合藥典規(guī)定。

2.2.4 加樣回收率試驗精密稱取已知量的樣品10.00 g，共5份。分別加入葡萄糖對照品約18 mg，按2.2項下方法提取，測定結(jié)果平均回收率為97.89%，RSD為0.51%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3 柘木多糖水提過程中單因素的影響研究

2.3.1 液料比考察精密稱取10.00 g干燥至恒重的柘木粉末(過20目篩)4份，按2.2項下方法操作，用不同倍量的水提取，測定多糖量。每份平行做3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1時，提取多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.756、0.822、0.598、0.246 mg/g。可見在20倍時總多糖提取量最高。

2.3.2 提取時間考察精密稱取10.00 g干燥至恒重的柘木粉末(過20目篩)4份，按2.2項下方法操作，在不同的時間下提取，測定多糖量。每份平行做3次，得平均值。結(jié)果提取時間為1、2、3、4 h時，提取多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.620、0.675、0.830、0.808 mg/g?？梢娫? h總多糖提取率最高。2.3.3提取溫度考察精密稱取10.00 g干燥至恒重的柘木粉末(過20目篩)4份，按2.2項下方法操作，在不同溫度提取，測定多糖量。每份平行做3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果提取溫度為70、80、90、100℃時，提取多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.178、1.322、1.949、1.670 mg/g，可見在90℃時總多糖提取率最高。

2.4 正交試驗設(shè)計通過單因素實驗確定最佳因素水平，為了消除各因素間的相互影響，根據(jù)這些確定的因素，確定正交因素的各個水平。進(jìn)行正交實驗設(shè)計，見表2～4。

表2 因素水平

表3 L9(34)正交試驗結(jié)果

由方差分析可見，各因素對柘木總多糖提取效果的影響程度依次為C>A>B，提取溫度對柘木多糖得率有顯著影響，而提取溶媒倍量和提取時間無顯著影響。因此，柘木總多糖的最佳提取工藝為A1B2C2，即10倍提取溶媒，提取溫度為90℃，提取時間為3 h。

2.5 驗證實驗按實驗所得最佳提取條件(10倍水，提取溫度為90℃，提取時間為3 h)進(jìn)行了4次驗證試驗，結(jié)果:平均總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.89 mg/g，RSD<3%(n=3)。

表4 方差分析

3 小結(jié)與討論

3.1 實驗對各因素分別進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度高于90℃或者提取時間長于3 h均能導(dǎo)致多糖提取量的下降，這是提取溫度過高或者受熱時間過長，導(dǎo)致部分多糖結(jié)構(gòu)被破壞甚至降解，多糖提取率下降。

3.2 液料比考察結(jié)果當(dāng)液料比為20∶1時總多糖的提取量最高，之后隨著液料比的增大多糖的提取量開始下降，這可能是由于雜質(zhì)溶出量增加而抑制了多糖的溶出，導(dǎo)致了多糖提取量的下降。

3.3 正交試驗結(jié)果只有C因素有顯著性差異。通過單因素考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取時間為3 h遠(yuǎn)高于2 h的多糖提取量，因此選擇3 h為提取時間，其它因素宜采用工藝簡單、成本低廉的原則進(jìn)行選擇。

3.4 實驗采用單因素考察確定正交因素水平，建立正交實驗方法，對柘木多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。由單因素實驗和正交分析結(jié)果得知，提取溫度是主要影響因素，其次是提取溶媒的倍量;提取時間3 h內(nèi)無顯著差異。柘木總多糖的最佳提取工藝條件為:溫度為90℃，時間為3 h，液料比為10∶1。該工藝條件簡單，穩(wěn)定可行，可用于柘木多糖的提取。

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