HPLC-ESI-MSn法測定黃芪藥材中黃芪甲苷

李 晶， 韋露莎， 申旭霽， 趙新鋒， 王世祥， 鄭曉暉，2*

（1.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069;2.西北大學與深圳清華大學研究院共建“創新中藥及天然藥物研究”聯合實驗室，廣東深圳 518057）

黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，是中醫臨床廣泛用于補氣固表和托毒排膿的藥材之一［1］。黃芪含皂苷、黃酮、多糖及氨基酸等多種化學成分，黃芪皂苷為黃芪的主要活性成分，并以黃芪甲苷為主［2］。目前，有關黃芪甲苷的測定方法包括高效液相色譜-蒸發光散射檢測法，高效液相色譜-紫外檢測法，薄層掃描法［3-5］。上述方法對黃芪藥材及其制劑中黃芪甲苷的測定有重要意義，且有潛在的推廣應用前景。然而，由于黃芪甲苷為紫外末端吸收物質，其在復雜體系中高效測定方法的建立仍然是需進一步研究的問題之一。本試驗建立了黃芪醇提物中黃芪甲苷的高效液相色譜-電噴霧-離子阱（HPLC-ESI-MSn）測定方法，旨在為復雜體系中黃芪甲苷的快速測定提供方法。

1 儀器與試藥

儀器:Agilent1100系列高效液相色譜-電噴霧-離子阱質譜聯用儀，包括二元梯度泵、二極管陣列檢測器、電噴霧離子源、SL型離子阱質譜和Chemistation 5.2工作站。

材料及試劑:黃芪（購于西安藻露堂藥店，經西安市藥品檢驗所鑒定）;黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:110781-200613）;色譜純甲醇（美國Fisher公司）;實驗用水為超純蒸餾水（自制）;其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 分析條件

色譜條件:色譜柱為 Agilent SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為甲醇-0.2% 甲酸水（70 ∶30，v∶v）;體積流量為0.7 mL/min;檢測波長為203 nm;柱后2:1分流，三分之一流出液進行質譜分析。

質譜條件:電噴霧正離子模式檢測;霧化氣壓力為35.0 psi;干燥氣溫度為350℃，流速為8.0 L/min;黃芪甲苷選擇離子對為m/z807.4→627.2;質量掃描范圍為100～1 000 amu。該條件下，黃芪藥材中黃芪甲苷提取離子流圖和質譜圖分別見圖1和圖2。

2.2 供試品溶液的制備 黃芪甲苷對照品溶液的制備:精密稱取黃芪甲苷標準品5.2 mg，甲醇溶解于5.0 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，制備成濃度為1.04 mg/mL的對照品溶液。

圖1 黃芪甲苷提取離子流圖

黃芪藥材供試品溶液的制備:取黃芪藥材20.0 g，50.0℃干燥至恒重。粉碎，過40目篩，準確稱取藥材粉末5.0 g，置具塞錐形瓶中，加10倍量甲醇，冷浸過夜，超聲提取3次，每次30 min，濾過，合并濾液，減壓濃縮至干，殘渣用甲醇溶解至10.0 mL量瓶中，加甲醇至刻度，4.0℃冷藏備用［6］。

2.3 線性關系考察 精密吸取2.2項下對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL，用甲醇稀釋并定容到 1.0 mL 量瓶中，制備系列質量濃度對照品溶液。在擬定分析條件下，準確吸取10.0 μL進樣分析。黃芪甲苷離子選擇m/z807.4為母離子，627.2為子離子，測定提取離子流圖峰面積［7-8］。以質量濃度為橫坐標，以提取離子流圖峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為:Y=379.18X+9.052 1（r=0.999 7），提示黃芪甲苷在0.10～1.04 mg/mL范圍內線性關系良好。以3倍信噪比為標準，測得黃芪甲苷的最低檢測限為5 ng/mL（S/N=3）。

圖2 黃芪甲苷質譜圖

2.4 精密度實驗 在擬定分析條件下，精密吸取黃芪藥材供試品溶液10.0 μL，連續進樣5次，記錄提取離子流圖峰面積，測定黃芪甲苷量，計算得相對標準偏差（RSD）為2.7%，提示該方法具有較好的精密度。

2.5 重復性實驗 取同一黃芪樣品5份，按2.2項下方法制備供試品溶液，在擬定分析條件下，準確吸取10.0 μL進樣分析，測定黃芪甲苷量，計算得RSD為3.2%，提示該方法重復性良好。

2.6 穩定性實驗 取黃芪藥材供試品溶液，分別在0、4、8、16、24 h和36 h后，在擬定分析條件下，準確吸取10.0 μL進樣分析，測定黃芪甲苷量，計算得RSD為2.4%，提示黃芪供試品溶液在36 h內穩定性良好。

2.7 加樣回收率實驗 精密稱取5份黃芪甲苷量已知的黃芪藥材，每份5.0 g，分別準確加入濃度為1.04 mg/mL黃芪甲苷對照品溶液2.0 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液。在擬定分析條件下，準確吸取10.0 μL進樣分析，測定黃芪甲苷量，結果見表1。由表1可見，方法平均回收率為96.51%，表明該方法具有較好的回收率。

表1 加樣回收率實驗結果 （n=5）

2.8 樣品測定 分別精密稱取黃芪藥材3份，每份5.0 g，按2.2項下方法制備供試品溶液。在擬定分析條件下，準確吸取10.0 μL進樣分析，測定黃芪甲苷質量分數。結果表明，供試藥材中黃芪甲苷的平均質量分數為0.54 mg/g。

3 討論

3.1 黃芪甲苷為末端紫外吸收物質［9］，采用紫外檢測法進行測定，一般具有靈敏度差等不足。蒸發光散射檢測器雖然能用于黃芪甲苷等紫外末端吸收物質的測定，但線性范圍一般低于3個數量級，且在靈敏度方面與紫外相比并未顯示出獨特的優勢。質譜法以氣態離子為檢測對象，檢測靈敏度不受待測對象紫外光吸收性質的限制，在紫外末端吸收物質的測定方面具有獨特的優勢。因此，本試驗以質譜法為手段，進行黃芪藥材中黃芪甲苷的測定。

3.2 本試驗采用多級反應模式即選擇離子對法進行黃芪甲苷的測定。該方法以黃芪甲苷的準分子離子m/z807.4和二級碎片離子m/z627.2為離子對對藥材中的黃芪甲苷進行定性，具有特異性強的特點。此外，由于選擇離子對法能有效排除復雜體系中的基質對待測對象的干擾，因此不僅能有效縮短分析時間，而且靈敏度高。綜上，本試驗所建立的黃芪藥材中黃芪甲苷的測定方法，具有靈敏度高，重現性好和快速的特點，可用于黃芪藥材的質量評價，而且有望為生物樣品等復雜體系中黃芪甲苷的快速測定提供方法。

［1］中國藥典［S］.一部.2010:283-284.

［2］江 燕，晁若冰.黃芪藥材中黃芪甲苷和總皂苷含量的比較［J］.華西藥學雜志，2007，22（3）:322-324.

［3］蔣紅艷，楊元娟，何 靜，等.黃芪及其制劑中黃芪甲苷定量分析方法研究進展［J］.中國醫藥指南，2009，7（10）:209-211.

［4］周春玲，魯 靜.高效液相色譜-蒸發光散射檢測法測定黃芪中黃芪甲苷的含量［J］.中國中藥雜志，2000，25（3）:166-168.

［5］莫 迎，陸石英，葉 萍，等.HPLC-ELSD測定芪丹益肝膠囊中黃芪甲苷含量［J］.中成藥，2009，31（10）:附4-附6.

［6］南換杰，李曉娜，秦雪梅，等.黃芪及其制劑中測定黃芪甲苷含量時供試液制備方法的改進［J］.中國醫院藥學雜志，2009，29（19）:1627-2630.

［7］Huang Chenrong，Wang Guangji，Li Hao，et al.Sensitive and selective liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry analysis of astragaloside IV in rat plasma［J］.Pharm Biomed Anal，2006，（40）:788-793.

［8］賈曉斌，陳 彥，蔡寶昌，等.HPLC-MS（TOF）法測定家兔血漿中黃芪甲苷的濃度［J］.中成藥，2005，27（3）:323-325.

［9］毛文彬，相 莉，馮 偉.HPLC-ELSD測定黃芪藥材及其炮制品中黃芪甲苷的含量［J］.齊齊哈爾醫學院學報，2008，29（15）:1853-1854.