高效液相色譜法優選四味中藥的提取方法

容 蓉， 邱麗麗， 呂青濤， 蔣海強， 王 薇， 李 峰

（1.山東中醫藥大學，山東濟南 250355;2.勝利油田中心醫院，山東東營 257000）

中藥寒、熱、溫、涼的藥性是其所含成分作用于機體的客觀反映，是區別于植物藥和天然藥的重要標志［1］。自上世紀70年代以來，很多學者對中藥四性的物質基礎進行了探索研究，但哪些成分起寒涼作用、哪些起溫熱作用，藥性是中藥單一成分的作用、還是多種成分的綜合表現，尚須深入研究［2］。在總結近40年研究工作的基礎上，歐陽兵等提出“組群中藥四性組合性效譜”假說，認為中藥的起效機制是整體調節，中藥調治寒熱二證的物質基礎應是組成中藥的所有化學成分的整體協同作用［3］。

通過測定寒性、熱性中藥的HPLC圖譜，盡可能獲得其化學成分的整體信息，將有助于比較其物質基礎的共性和差異。本實驗選取藥性明確的二味寒性中藥（蒲公英、金銀花）和二味熱性中藥（干姜、仙茅），采用HPLC法測定，以未知成分的HPLC特征峰數據（總色譜峰數量和總色譜峰面積）為指標，通過正交試驗優選這四味中藥的提取方法，為后續的以HPLC圖譜表征寒性、熱性中藥的物質信息奠定基礎。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（DAD檢測器，二元高壓梯度泵，柱溫箱;美國安捷倫公司）;KQ-250E型醫用超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）;Mettler AE 240電子天平（瑞士梅特勒公司）。

蒲公英Taraxacum mongolicumHand.Mazz.、金銀花Lon-icera japonicaThunb.藥材購自山東省臨沂市，干姜Zingiber officinaleRosc.、仙茅Curculigo orchioidesGaertn.藥材分別購自四川省犍為市和宜賓市，經山東中醫藥大學藥學院李峰教授鑒定，均為道地藥材;乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）;水為娃哈哈純凈水;其它試劑均為分析純（天津科密歐化學試劑開發中心）。

2 方法與結果

2.1 提取方法的正交試驗設計 本實驗對粉碎粒度（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、甲醇濃度（D）等對提取效果影響較大的因素，通過正交試驗設計進行考察，結果見表1。

表1 正交試驗因素水平

2.2 供試藥液的制備 分別取二味寒性中藥-蒲公英（1#）、金銀花（2#）、二味熱性中藥-干姜（3#）、仙茅（4#）粉末0.5 g各9份，按照表1設計的因素水平進行L9（34）試驗，試驗樣品編號見表2、表3，超聲提取，提取完畢，放至室溫，再次稱定質量，用相應濃度的甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，作為HPLC供試藥液。

2.3 HPLC圖譜色譜條件的建立 色譜柱:Agilent XDB-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動相:乙腈-水（3 ∶97）→乙腈-水（100∶0），90 min，線性梯度洗脫;體積流量:1.0 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:35℃。檢測波長分別為1#:366 nm、2#:236 nm、3#:220 nm、4#:206 nm。

表2 二味寒性中藥正交試驗結果

表3 二味熱性中藥正交試驗結果

2.4 指標數據標準化處理 以各藥材供試液在相應波長下的色譜峰總數量（total peak number，簡稱TPN）和色譜峰總面積（total peak area，簡稱TPA）為考察指標。因各指標變量單位和量綱不同且變量范圍相差懸殊，對不同性質指標直接加和不能正確反映不同作用力的綜合結果，故對這兩組數據按照公式（1）進行標準化處理;將標準化后的各指標數據求和，即得綜合評價值Y，寒性和熱性中藥樣品試驗結果分別見表2、表3。

xi，j為第i個樣品的指標j的測定值，j為1-9號樣品指標j的平均測定值，x′i，j為第i個樣品的指標j的標準化數據。

2.5 正交試驗結果分析 正交試驗的極差分析結果見表2、表3。直觀分析結果表明，四味中藥皆以因素D（甲醇濃度）為主要影響因素，通過直觀分析優選各藥味的最佳提取條件見表4。

表4 正交試驗優選結果

在正交設計中，如果沒有重復試驗，又無空白項時，常取其中離均差平方和最小的因素項作為誤差估計，用以檢驗其他因素作用的顯著性［4］。本實驗采用SPSS11.5軟件對表2、表3中的正交試驗結果進行方差分析［5］。首先不考慮試驗誤差，將A、B、C、D四個因素都作為處理因素，進行分析;根據分析結果，取各組數據分析結果中SS最小的因素作為誤差估計，檢驗其它因素作用的顯著性，再次進行統計分析，結果見表5。

表5 正交試驗數據方差分析

經方差分析可知，因素D（甲醇濃度）對4種中藥的提取效率均有顯著性影響，因素A（粉碎粒度）、B（提取時間）、C（提取溫度）對各味中藥的提取效率作用不顯著。為了統一提取方法，以便平行比較寒性、熱性中藥物質基礎的差異，綜合考慮各因素的影響，確定以A2B2C3對寒性、熱性中藥進行提取。從表4可知，二味寒性中藥的最佳提取溶劑為50%甲醇。熱性中藥仙茅為70%甲醇;干姜雖為90%甲醇，但與70%甲醇提取效率相差不大。為了使提取液盡可能地反映寒性、熱性中藥物質基礎信息，同時保證提取方法的一致性，確定同時用50%甲醇和70%甲醇兩種溶劑對2味寒性、2味熱性中藥進行平行提取。綜上，4味中藥的最佳提取條件為:40目藥材粉末，平行采用50%和70%的甲醇，60℃水浴超聲提取30 min。

2.6 驗證試驗 按照以上確定的最佳提取條件，對4味中藥分別平行提取3批，測定其HPLC圖譜，計算其HPLC特征峰TPN和TPA，將其與正交試驗結果數據合并后進行標準化處理，計算綜合評價值Y，發現驗證試驗綜合值Y均優于正交試驗的各次測定結果，見表6，證明該方法穩定、可靠。

表6 驗證試驗結果

3 討論

3.1 關于藥性作用物質基礎的研究，若偏重于單一或幾種已知成分，將無法對其從整體上進行把握。劉培勛等提出“中藥藥性物組學”觀點［6］，建議采用現代色譜、光譜技術，獲取中藥全化學成分的物質組信息，以期闡明中藥藥性理論的本質。針對不同藥性的中藥進行分析、測定，獲取其盡可能全面的化學成分信息，進而通過數據分析和信息挖掘，尋找寒性、熱性中藥化學信息的共性規律，可以有助于最終闡明寒性、熱性中藥藥性、藥效及物質基礎的相關性。本實驗通過建立HPLC圖譜盡可能反映中藥的整體化學信息，對2味寒性、2味熱性中藥的提取方法進行了優化。

3.2 實驗過程中，首先比較了回流提取與超聲提取的優劣，發現超聲提取的效率較高;其次分別對粉碎粒度、提取時間、提取溫度、甲醇濃度進行單因素考察，發現粒度過細、時間過長、溫度過高對于提取效果并沒有太大影響;同時，當甲醇濃度過低時（30%、40%），并不能提高提取液中色譜峰的數目和峰面積，反而會因甲醇濃度過低，提取液中多糖含量增加，不利于HPLC分析;據此設定了各因素的水平。

3.3 建立中藥藥性指紋圖譜，將有助于實現指紋圖譜特征和藥性相關性研究［7］。本實驗在提取效率的評定指標選取方面，基于中藥部分成分已知、大部分成分未知的現實，本實驗在構建供試藥液HPLC圖譜的基礎上，以其總色譜峰數量和總色譜峰面積為指標，嘗試針對未知結構的多成分的模糊數據進行統計分析，優選寒性、熱性中藥的共性提取方法，較以往更加注重多種成分的群體效應，為通過HPLC圖譜尋找不同藥性中藥物質信息的共性規律奠定基礎。

3.4 由于每味中藥所含成分各不相同，若HPLC分析時采用相同檢測波長難免會有失偏頗，故本實驗采用二極管陣列檢測器對樣品進行全波長檢測，以色譜峰數量和色譜峰總面積為指標，通過對光譜等勢圖的分析，優選了對各味中藥供試液檢測靈敏度最高的檢測波長。

［1］鄧家剛，秦華珍，秦海洸.中藥藥性效應及物質基礎的文獻研究［J］.河南中醫，2007，27（5）:82-84.

［2］余惠旻，周紅祖，肖小河，等.中藥四性的研究進展與展望［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2001，7（8）:621-624.

［3］歐陽兵，王振國，王 鵬，等.“組群中藥四性組合性效譜”假說及其論證［J］.山東中醫雜志，2006，25（3）:153-156.

［4］張春華，嚴云良主編.醫藥數理統計［M］.北京:科學出版社，2001:212.

［5］胡志潔.SPSS 11.5軟件在正交試驗設計中的應用［J］.醫學信息，2007，20（5）:737-740.

［6］劉培勛，龍 偉.中藥藥性與中藥藥性物組學［J］.中國中藥雜志，2008，33（14）:1769-1771.

［7］雷鈞濤，孫曉華，張笑波，等.基于理化指紋圖譜信息提取及模式識別的中藥藥性理論研究方法［J］.遼寧中醫雜志，2010，37（2）:317-318.