超聲強化超臨界提取大黃中5種蒽醌衍生物的研究

李衛民， 王治平， 劉 杰， 葉雪蘭， 邱志兵， 李慶國

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006)

大黃來源于蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖。具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經之功，用于實熱便秘，積滯腹痛，瀉痢不爽，濕熱黃疸等［1］。其主要成分為蒽醌衍生物，制劑多采用煎煮法提取［2］，蒽醌類成分因受熱時間過長而降解，致通腸作用明顯減弱［3］，同時也影響提取率。超臨界流體萃取(SFE)技術在很大程度上避免了傳統提取過程的缺陷，并且屬于環境友好的綠色提取技術［4-5］。但是，該技術也存在一些需要解決的問題，如高壓操作，對設備的要求高，萃取效率有待進一步提高等［6］。超聲能產生空化效應，具粉碎、攪拌、乳化等特殊作用，使植物組織在溶劑中瞬時產生的空化泡的崩潰，而使組織中細胞破裂，以利于溶劑浸透到植物細胞內部，使植物中的有效成分溶于溶劑之中［7］。目前已有相關文獻報道將超聲技術引入到SFE萃取中，并探討了超聲參數對萃取率的影響［6］。

本試驗采用自行設計改造的超聲強化超臨界流體萃取裝置，以大黃藥材中5種蒽醌衍生物成分為提取對象，比較超聲提取(U)、超臨界流體萃取(SFE)和超聲強化超臨界流體萃取(USFE)提取大黃5種蒽醌衍生物成分的提取率。為開發植物藥有效成分提取新技術和大黃及其復方制劑的工業化生產提供參考。

1 儀器與試藥

超臨界提取裝置(江蘇華安科研儀器有限公司，5 L)，超聲波發生器(廣州華南超聲設備有限公司，超聲強度2 000 W，頻率20 kHz)，超聲強化超臨界提取裝置(自行設計，由上述2種設備改裝而成)示意圖見圖1;CO2氣體購于廣州億祥貿易公司供應，純度達99.5%以上;SHIMADZU LC-10AT vp plus高效液相色譜儀，SHIMADZU SPD-10A vp plus紫外檢測器，SHIMADZU CBM-10A vp plus化學工作站;Sartorius CP225D電子分析天平(德國，d=0.01 mg);鹽酸、三氯甲烷、甲醇、乙醇等為分析純，水為制備純水。對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(含量測定用，批號分別為:蘆薈大黃素110795-200605，大黃酸110757-200206，大黃素110756-200110，大黃酚110796-200615，大黃素甲醚110758-200610)。大黃藥材購自廣州中醫藥大學大藥房有限公司，由本院李薇教授鑒定為廖科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.干燥根及根莖。

圖1 超聲強化超臨界提取裝置示意圖

2 方法與結果

2.1 大黃的預處理 取大黃飲片，粉碎，過100目篩，混勻，即得。

2.2 大黃蒽醌類成分的提取 參照大黃SFE提取的穩定工藝參數［8］，采用平行試驗的方法，比較超聲、超臨界和超聲強化超臨界的提取效果。

2.2.1 超聲提取(U)［9-10］稱取大黃粉末100.0 g，置1 L萃取釜中，加4 BV乙醇超聲提取2 h(超聲強度:1 000 W，間歇2 min工作)，從放料口收集乙醇提取液，50℃減壓回收至無乙醇滴出，得萃取物。

2.2.2 超臨界提取(SFE)［5，8］稱取大黃粉末 100.0 g，置 1 L萃取釜中，按如下條件萃取2 h:夾帶劑乙醇用量2 BV，萃取壓力18 MPa，萃取溫度50℃，分離壓力5 MPa，分離溫度35℃，收集萃取液，50℃減壓回收至無乙醇滴出，得萃取物。

2.2.3 超聲強化超臨界提取(USFE) 稱取大黃粉末100.0 g，置1 L萃取釜中，按如下條件萃取1.5 h:超聲強度:1 000 W，間歇2 min工作，夾帶劑乙醇用量1.5 BV，萃取壓力18 MPa，萃取溫度40℃，分離壓力5 MPa，分離溫度35℃，收集萃取液，50℃減壓回收至無乙醇滴出，得萃取物。

2.3 供試溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 按文獻方法制備［1，11］，即得每1 mL 中含蘆薈大黃素16.133 μg、大黃酸15.601 μg、大黃素 15.092 μg、大黃酚 16.117 μg、大黃素甲醚 8.109 μg 的混合對照溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取上述萃取物0.1 g，置燒瓶中，同藥典大黃藥材含量測定項下方法，自“加8%鹽酸溶液，超聲2 min，再加三氯甲烷10 mL”起同法制備供試液，再用甲醇稀釋10倍，搖勻，濾過，即得。

2.4 色譜條件［1，12］色譜柱:Kromasil 100-5 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，加預柱;流動相:甲醇 -0.1%磷酸溶液(85∶15);體積流量:1.0 mL/min，柱溫:30 ℃，進樣量:10 μL，檢測波長:254 nm。

2.5 線性關系考察 精密吸取混合對照溶液1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μL，注入液相色譜儀，測定，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品進樣質量(ng)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果見表1。

2.6 樣品測定 精密吸取上述對照溶液及供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定并計算各成分質量分數，色譜圖見圖2，結果見表2。

表1 各對照品線性關系考察結果

圖2 蒽醌衍生物HPLC測定色譜圖

由表2可知，提取物中蒽醌衍生物量高低:超聲強化超臨界提取＞超臨界提取＞超聲波提取;提取物中蒽醌衍生物的提取率大小:超聲強化超臨界提取＞超聲波提取＞超臨界提取。因超聲波提取時溶劑用量較多，提取物得率較高，使其對蒽醌衍生物的提取率有所提高。

試驗表明，超聲強化超臨界流體提取大黃5種蒽醌衍生物的量及提取率均高于單獨的超聲和超臨界提取。

2.7 驗證試驗 上述試驗過程中收集萃取物時發現萃取物的顏色變化，由褐黃色變為鮮黃色再變為淡黃色。為探討此現象的原因并驗證超聲強化超臨界提取工藝，進行如下試驗。提取條件:萃取溫度為40℃，提取時間1.5 h，超聲強度1 000 W，夾帶劑乙醇用量為2 BV，每0.5 BV收集萃取物，測定蒽醌衍生物量和提取率。結果見表3。

表2 不同提取方法對大黃蒽醌衍生物提取效果試驗結果 (n=2)

表3 不同時段收集萃取物中大黃蒽醌衍生物測定結果 (n=2)

由表3可知，第2個0.5BV萃取物中的蒽醌衍生物量及提取率最高，第1個0.5BV次之，第3個0.5BV最低。第2個0.5BV萃取物中大黃酚量高達81.638%，如果欲制備高含量的有效部位，可以采取分段收集的方法。

3 結論與討論

3.1 試驗結果表明，USFE的合適萃取溫度、萃取時間和夾帶劑用量分別低于SFE的10℃、30 min、0.5 BV，在相同的萃取壓力下，USFE對5種蒽醌衍生物成分的提取率較SFE分別提高2.113%～6.095%。超聲強化超臨界流體提取大黃5種蒽醌衍生物的量及提取率均明顯高于單獨的超聲和超臨界提取。

3.2 研究顯示，超臨界提取和超聲波提取技術在中藥提取分離方面具有廣泛的應用前景，兩者的成功聯用尚未見相關文獻報道，它對有效成分的提取純化和制劑工藝研究具有巨大的推動作用，也為其他的中藥產品工藝改進提供新的方法。

3.3 超聲強化超臨界流體提取技術成功整合了兩者在提取方面的優勢，避免了兩者的劣勢，減少夾帶劑的用量，降低回收工作量及成本，避免萃取物中的有效成分長時間加熱而被破壞，同時縮短提取時間，提高工作效率。

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