中藥中赭曲霉毒素A的測(cè)定

鄭榮，簡龍海，毛丹，王少敏，王柯，季申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201210)

赭曲霉毒素是赭色曲霉屬Ochraceors和幾種青霉屬真菌產(chǎn)生的一種毒素，包括A、B、C等7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A)被公認(rèn)為是目前致癌力最強(qiáng)的天然物質(zhì)之一。毒理學(xué)資料表明，這種致癌作用主要體現(xiàn)在肝臟與腎臟，并被認(rèn)為與人類的巴爾干腎病有關(guān)，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC將其定為2B類致癌物［1-2］。

目前對(duì)赭曲霉毒素的研究多集中在谷物、糧油等食品樣本中［3］，各國針對(duì)糧食中的赭曲霉毒素也制定了嚴(yán)格的限度標(biāo)準(zhǔn)。而在與食品具有類似基質(zhì)的中藥中尚未建立相應(yīng)的檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)。2000年6月8日，美國《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》報(bào)道了43位服用含有馬兜鈴屬中草藥及千金藤、玉木蘭減肥藥而出現(xiàn)嚴(yán)重腎功能衰竭，其中4例有赭曲霉毒素(存在于千金藤)中毒的證據(jù)。為此，建立中藥中赭曲霉毒素A的檢測(cè)方法，不僅可以確保人民用藥安全，也可以為監(jiān)督執(zhí)法提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的赭曲霉毒素A的分析測(cè)定方法有薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)［4-12］。，由于中藥基質(zhì)復(fù)雜，TLC法和ELISA法受方法本身的限制，假陽性率較高。經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索研究，建立了中藥中免疫親和凈化-高效液相色譜的測(cè)定方法，陽性樣品采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確證。該方法快速靈敏，回收率高、準(zhǔn)確度好、可作為中藥中赭曲霉毒素A的測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

高速均質(zhì)器(德國IKA公司);赭曲霉毒素A免疫親和柱(美國VICAM公司);美國Agilent 1100高效液相色譜儀，熒光檢測(cè)器，赭曲霉毒素A對(duì)照品(Sigma公司提供，批號(hào):126K4026)。

香豆豉、防己、薏苡仁、補(bǔ)骨脂、麥芽、稻芽、白扁豆、綠豆、赤小豆藥材均由華宇藥材有限公司提供，經(jīng)上海市食品藥品檢驗(yàn)所鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-2%冰乙酸水溶液(49∶51)為流動(dòng)相，體積流量1.0 mL/min;以熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長477 nm。進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)以赭曲霉毒素A計(jì)應(yīng)不低于4 000。對(duì)照品溶液及陽性樣品的色譜圖見圖1～2。

圖1 赭曲霉毒素A對(duì)照品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ochratoxin A standard

圖2 陽性樣品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of ochratoxin A contaminated sample

2.2 供試品溶液的制備取樣品粉末20g(過二號(hào)篩)，精密稱定，加入氯化鈉5 g，80%甲醇100 mL，高速攪拌2 min，離心5 min(離心速度2 500 r/min)，精密吸取上清液10 mL，用水稀釋至50 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL，通過免疫親合柱(體積流量3 mL/min.)，隨后用水20 mL洗脫(體積流量6 mL/min.，必要時(shí)可以先用10 mL淋洗緩沖液(稱取25 g氯化鈉、5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1 L，即可)洗脫，再用10 mL水洗脫)，洗脫液棄去，精密量取1 mL甲醇洗脫(體積流量1 mL/min.)，收集甲醇洗脫液，即得。

2.3 線性關(guān)系精密稱取赭曲霉毒素A對(duì)照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的赭曲霉毒素A對(duì)照品貯備液(4℃冰箱保存)。分別精密吸取對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋制得質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、15、20 ng/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算。結(jié)果赭曲霉毒素A的回歸方程為Y=0.229X+0.049 4，r=0.999 94。表明赭曲霉毒素A在1～20 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)取質(zhì)量濃度為2 ng/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明，進(jìn)樣精密度為0.5%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)分別取薏苡仁及麥芽的陽性樣品粉末(過二號(hào)篩)20 g，一式6份，精密稱定，按供試品溶液的制備項(xiàng)下依法操作，進(jìn)樣分析，計(jì)算RSD值分別為6.6%和9.7%，表明重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果良好。

供試品溶液采用LC-MS/MS進(jìn)行陽性確證，結(jié)果(見表1)供試品溶液中定性離子的豐度比與對(duì)照品溶液中定性離子的豐度比相接近(偏差均小于15%)。

表1 質(zhì)譜確證結(jié)果Tab.1 LC-MS/MS confirmation results

2.6 回收率試驗(yàn)取樣品粉末(過二號(hào)篩)20 g，精密稱定，一式12份，分別精密加入赭曲霉毒素A對(duì)照品50 ng、80 ng及300 ng，做為低、中、高三種濃度添加水平的供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算得平均回收率(見表2)，結(jié)果表明本方法回收率試驗(yàn)結(jié)果良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取回收率試驗(yàn)項(xiàng)下中濃度添加水平的樣品，每隔4 h進(jìn)樣分析，記錄測(cè)得量(單位:pg)，見表3，結(jié)果表明，在0～24 h之內(nèi)，供試品溶液保持穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of stablity/pg

2.8 檢測(cè)限測(cè)定低濃度回收率供試品溶液的信噪比，以信噪比3∶1計(jì)算得本方法檢測(cè)限為1 μg/kg，以信噪比10∶1計(jì)算得本方法定量限為3 μg/kg。

2.9 樣品測(cè)定

2.9.1 國際實(shí)驗(yàn)室能力測(cè)試結(jié)果按照本實(shí)驗(yàn)所述方法參加由英國實(shí)驗(yàn)室CSL主辦的能力驗(yàn)證測(cè)試項(xiàng)目，一式3份的結(jié)果分別為6.32 μg/kg、6.14 μg/kg、6.10 μg/kg，與中位值為6.16 μg/kg接近。2.9.2樣品測(cè)定結(jié)果對(duì)上述8種共計(jì)21批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果1批薏苡仁檢出赭曲霉毒素A(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 μg/kg)，1批麥芽檢出赭曲霉毒素A(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 μg/kg)。

2.10 確證實(shí)驗(yàn)供試品溶液制備方法中使用的免疫親和柱對(duì)赭曲霉毒素具有專屬性吸附，因此一般情況下供試品溶液的高效液相色譜圖比較干凈，出現(xiàn)假陽性的情況比較少。筆者在近幾年的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著監(jiān)測(cè)品種范圍和檢驗(yàn)樣品數(shù)量的擴(kuò)大，某些基質(zhì)復(fù)雜的樣品，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性的情況。因此進(jìn)一步的確證實(shí)驗(yàn)就顯得非常必要。通常，建議通過改變色譜條件比如更換儀器和色譜柱，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例等手段進(jìn)行考察。有條件的實(shí)驗(yàn)室，則應(yīng)通過LC-MS進(jìn)行確證。

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS-MS對(duì)上述陽性樣品進(jìn)行了確證實(shí)驗(yàn)。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm);以甲醇為流動(dòng)相A相，以0.01%甲酸為流動(dòng)相B相，體積流量0.3 mL/min;按表4進(jìn)行梯度洗脫。

表4 流動(dòng)相梯度Tab.4 Mobile phase gradient program

離子源為電噴霧離子化源ESI(-)源;毛細(xì)管去簇電壓、碰撞池能量等質(zhì)譜參數(shù)見表5。

表5 質(zhì)譜參數(shù)表Tab.5 LC-MS/MS parameters

3 討論

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

3.1.1 波長的選擇分別考察了①激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長477 nm，②激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長477 nm，③激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長460 nm，④激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長420 nm，⑤激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長440 nm。結(jié)果以激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長477 nm所得色譜峰峰面積最大，峰高最高。

3.1.2 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇分別考察了①乙腈-水(40∶60)、②乙腈-0.012 mol/L磷酸鈉溶液pH7.5(60∶40)，1 g/L十六烷基三甲基溴酸銨、③乙腈-2%冰醋酸(49∶51)3種流動(dòng)相，對(duì)稱因子分別為0.75、0.81、0.84。故選用對(duì)稱因子較好且配制比較方便的乙腈-2%冰醋酸(49∶51)為流動(dòng)相。

3.1.3 色譜柱的選擇分別考察了①INTERSILODS 3(5 μm，4.6 mm×150 mm)、②Agilent CB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、③Waters C18(5 μm，2.1 mm×150 mm)3種色譜柱，對(duì)稱因子分別為0.81、0.83、0.76。色譜柱①及色譜柱②的對(duì)稱因子相對(duì)為好。

3.2 供試品溶液制備方法的考察

3.2.1 提取過程選用目前比較先進(jìn)的前處理手段進(jìn)行了不同提取過程的比較。取樣品粉末20 g(過二號(hào)篩)，分別考察了表6所述的提取溶劑及提取方式。結(jié)果表明，采用80%甲醇勻漿1 min即可提取完全，為保證提取效率，確定勻漿時(shí)間為2 min。

表6 不同提取溶劑及提取方式的比較Tab.6 Comparison of different extraction solvents and preparation methods

3.2.2 凈化過程分別取供試品溶液制備項(xiàng)下的續(xù)濾液10 mL、20 mL進(jìn)行凈化，結(jié)果表明上柱體積不影響測(cè)定結(jié)果，因此在不超過柱容量的前提下，可以通過增加上柱體積來提高供試品溶液中赭曲霉毒素A的濃度。

對(duì)淋洗液種類(淋洗緩沖液和水)及用量的考察結(jié)果表明，用20 mL水即可以去除大部分的雜質(zhì)干擾，因此，一般情況下不需要使用淋洗緩沖液，樣品中的干擾雜質(zhì)特別多的情況下可以先用10 mL淋洗緩沖液洗脫，再用10 mL水洗脫。

甲醇用量考察結(jié)果表明1 mL甲醇即可洗脫完全，增大甲醇用量會(huì)降低供試品溶液中赭曲霉毒素A的濃度，影響檢測(cè)靈敏度，為此確定甲醇的洗脫用量為1 mL。

3.2.3 濃縮過程將供試品溶液制備項(xiàng)下的甲醇洗脫液一份氮吹濃縮后進(jìn)樣分析，一份直接進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，氮吹不會(huì)造成赭曲霉毒素A的損失。因此，若供試品中赭曲霉毒素A的量過低，可以通過氮吹進(jìn)行濃縮，提高樣品中赭曲霉毒素A的濃度。

在不超出免疫親和柱最大載樣量的情況下，可以通過改變樣品稱樣量、加水量以及上柱體積，或氮吹等步驟來調(diào)整供試品溶液中赭曲霉毒素A的濃度，以達(dá)到良好的液相分離效果。

3.3 中藥中赭曲霉毒素的限量目前國內(nèi)外暫無中藥中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)。國際食品法典委員會(huì)提議赭曲霉毒素A在小麥、大麥、黑麥及其它們的制品中不得超過5 μg/kg。瑞士規(guī)定豬混合料中限度為200 μg/kg，家禽混合料中限度為1000 μg/kg。歐盟規(guī)定速溶咖啡中限度為6 μg/kg，烤制咖啡中限度為3 μg/kg，干果中限度為2 μg/kg，干無花果中限度為8 μg/kg。德國規(guī)定咖啡及其制品中限度為5 μg/kg。目前我國規(guī)定谷類食品中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 μg/kg［13-14］。據(jù)此，認(rèn)為可暫參照食品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定中藥中赭曲霉毒素A的限度為不得過5 μg/kg。

［1］張藝兵，鮑蕾，褚慶華.農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)分析［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

［2］Schlatter C，Studer-Rohr J，Rasonyi T.Carcinogenicity and kinetic aspects of ochratoxin A［J］.Food Addit Contam，1996，13(Suppl):43-44.

［3］蔡梅，曹玉潔，嚴(yán)小平.玉米、小麥中赭曲霉毒素A污染情況調(diào)查［J］.江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，1994，5(1):47-48.

［4］Entwisle A C，Williams A C，Mann P J，et al.Liquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup for determination of ochratoxin A in barley:collaborative study［J］.J Aoac Int，2000，83(6):1377-1383.

［5］GB/T23502-2009.食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定-免疫親和層析凈化高效液相色譜法［S］.

［6］GB/T 5009.96-2003.谷物和大豆中赭曲霉毒素A的測(cè)定［S］.

［7］時(shí)瑾，黃飚，孫蔚榕，等.ELISA法檢測(cè)赭曲霉毒素A的改進(jìn)研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(8):425-428.

［8］SN/T1746-2006.進(jìn)出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的檢驗(yàn)方法［S］.

［9］SN/T1940-2007.進(jìn)出口食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定方法［S］.

［10］Sibanda L，De Saeger S，Van Peteghem C.Optimization of solidphase clean-up prior to liquid chromatographic analysis of ochratoxin A in roasted coffee［J］.J Chromatogr A.2002，959(1-2):327.

［11］Entwisle A C，Williams A C，Mann P J，et al.Combined phenyl silane and immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography for determination of ochratoxin A in roasted coffee:collaborative study［J］.J Aoac Int，2001，84(2):444.

［12］樊祥，褚慶華，周瑤，等.反相高效液相色譜法測(cè)定張家口赤城大麥中赭曲霉毒素A的含量［J］.分析試驗(yàn)室，2007(S1):359-361.

［13］GB2715-2005.食品中真菌毒素限量［S］.

［14］GB2761-2005.食品中真菌毒素限量［S］.