黃精低聚糖的分離純化及理化性質研究

王彥志， 董晶晶， 劉富崗， 楊 云

(河南中醫學院藥學院，河南鄭州450008)

黃精Polygonti Rhizoma是百合科黃精屬Polygonatum多種植物的根莖，《中國藥典》(2010版)收載了滇黃精Polygonatum kingianum Coll．et Hemsl、黃精 Polygonatum sibiricum Red．或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua．的干燥根莖入藥［1］，在民間同屬其它一些植物的根莖也被當作黃精使用。作為一種傳統常用中藥，其性平，味甘，入脾、肺、腎經，具有補腎益精、滋陰潤燥等功效，臨床上多作為滋陰補益藥使用。所含化學成分豐富，有黃精多糖、皂苷、生物堿、醌類化合物、強心苷、木脂素、維生素和多種人體必需的氨基酸等化合物［2］。糖類是中藥中普遍存在的成分，可分為單糖、低聚糖、多糖及其衍生物。作為構成生命體的最基本物質之一，糖類在生命過程中起著極其重要的作用，它不僅是能量儲存和結構物質的存在形式，同時也作為生物信息的載體存在［3］。其中低聚糖因具有低熱量、高穩定性、安全無毒等特點，近年來在保健、食品、醫藥等領域被廣泛應用［4］，關于低聚糖的研究和應用也越來越受到人們的關注，但是由于自身在組成、連接、衍生化、微觀不均一性等方面的高度復雜性及其檢測上的困難，致使其分離純化研究較少［5］。近年來關于黃精低聚糖的分析尚未見報道，本實驗首次對其分離純化方法進行探索性研究，以期為低聚糖的綜合開發利用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 METTLER AE240電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);Revco ULT 1386-3-V39型超低溫冰箱(美國Thermo公司);Labconco Free Zone 6L真空冷凍干燥機(美國Labconco公司);UV-2201型紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

1．2 試藥 黃精藥材采集于河南省洛陽市欒川龍峪灣，經河南中醫學院生藥教研室董誠明教授鑒定為百合科黃精屬植物黃精Polygonatum sibiricum Red．的干燥根莖。將采挖的新鮮黃精除去蘆頭、須根及泥沙，清蒸1 h后干燥，粉碎，過20目篩，備用。D101大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司);活性炭粉末(天津市福晨化學試劑廠);硅藻土(天津市永大試劑化學開發中心);薄層層析硅膠G(青海海洋化工有限公司);Sephadex LH-20(瑞典GE Healthcare公司);茚三酮(上海市靈錦精細化工有限公司);咔唑(國藥集團化學試劑有限公司);葡萄糖(天津市科密歐化學試劑開發中心);蔗糖(天津市福晨化學試劑廠);果糖(南京藥學院實驗藥廠);棉子糖(上?；瘜W試劑廠);水蘇糖(ACROSORGANICS，生產批號:226085000);其它試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2．1 黃精中小分子糖的提取 稱取黃精藥材粉末500 g，加入12倍量80%乙醇，在85℃水浴條件下回流提取3 h，過濾，濾渣加10倍量的80%乙醇85℃水浴回流提取2 h，過濾，合并兩次濾液。將濾液用旋轉蒸發器濃縮至少量，濃縮液倒至蒸發皿中40℃水浴揮盡乙醇，得黃精小分子糖部位浸膏。

2．2 黃精低聚糖的分離與純化［6］

2．2．1 D101大孔吸附樹脂柱 取市售D101大孔吸附樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，再依次用0．4 mol/L HCl、0．4 mol/L NaOH 浸泡后，抽濾，蒸餾水洗至中性，濕法裝柱，蒸餾水作流動相平衡樹脂。稱取適量黃精小分子糖部位浸膏，用蒸餾水溶解后上樣，完畢以后，少量蒸餾水沖洗柱壁至無樣品黏附，保鮮膜封柱口，靜置過夜，使樹脂盡量將皂苷、黃酮等雜質完全吸附。蒸餾水洗脫，體積流量1 mL/min，洗脫至 Molish反應無紫色環出現為止，合并水洗脫部位溶液，用旋轉蒸發器減壓濃縮，備用。

2．2．2 活性炭柱層析 取活性炭粉末置于150℃烘箱中干燥2 h，用20%HCl煮沸30 min，趁熱抽濾，并用熱水洗滌至中性，110℃干燥后備用?；钚蕴颗c硅藻土按1∶1．5比例混合，用研缽攪拌均勻，干法裝于帶砂芯濾板的玻璃柱中，減壓抽實。將水洗脫部位濃縮液上活性炭柱，靜置過夜，使其充分吸附，蒸餾水洗脫至Molish反應檢識呈陰性，試驗中采用減壓裝置增加流量，每250 mL收集一份，合并水洗脫部位溶液并減壓濃縮。取活性炭水洗脫部位浸膏適量，用蒸餾水溶解后和單糖標準品溶液，分別點于硅膠G薄層板上，以異丙醇-乙酸乙酯-水(7∶1∶2)進行展開，取出，晾干后，噴苯胺-二苯胺-磷酸，置于85℃烘箱內，顯色。由薄層色譜圖(圖1)可知，水洗脫部位溶液除了可能含有大量的葡萄糖、果糖、蔗糖等小分子糖外，在棉子糖(三糖)下方有斑點出現，推測可能為聚合度大于3的低聚糖。

圖1 活性炭水洗脫部位薄層色譜圖

2．2．3 Sephadex LH-20凝膠柱層析 取活性炭水洗脫部位浸膏約1 g，少量蒸餾水溶解后，用0．45μm微孔濾膜過濾，注射器吸取濾液沿柱壁繞圈上樣，完畢以后用少量蒸餾水沖洗注射器與柱壁至無樣品吸附，于室溫下用蒸餾水進行洗脫，體積流量為0．5 mL/min，每管收集3 mL，共收集90份。

首先，采用薄層色譜法對洗脫樣品進行檢識，取樣品溶液和單糖標準品溶液，分別點于硅膠G薄層板上，以正丁醇-甲酸-水(4∶6∶1)進行展開，取出，晾干后，噴苯胺-二苯胺-磷酸，置于85℃烘箱內，顯色，結果如圖2。同時，采用紫外-可見分光光度法對洗脫組份進行檢測。苯酚-硫酸法隔管測定其吸收度，即取洗脫液0．4 mL置于具塞試管中，加蒸餾水0．4 mL、5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，搖勻后室溫放置30 min，以蒸餾水作空白對照，于波長490 nm處測定吸收度［7］。以洗脫管數為橫坐標，吸收度A為縱坐標，繪制洗脫曲線，如圖3。根據薄層色譜圖及洗脫曲線顯示將13～39合并作為黃精低聚糖樣品(RPO-1)，40～71合并作為小分子糖部位。將其減壓濃縮后－82℃真空冷凍干燥48 h，呈灰白色疏松粉末，密封保存備用。

圖2 Sephadex LH-20凝膠柱層析流份薄層色譜圖

圖3 Sephadex LH-20凝膠柱層析洗脫曲線

2．3 RPO-1的理化性質研究

2．3．1 RPO-1 為灰白色疏松粉末，微甜，無臭，易吸濕，水溶性好，極易溶于熱水，不溶于丙酮、乙醚、三氯甲烷和苯等有機溶劑，熱穩定性較好。

2．3．2 Molish反應 取1 mg/mL樣品溶液1mL，加入5%α-萘酚乙醇液1～3滴，搖勻后沿試管壁緩緩加入濃硫酸約2 mL，切勿搖動，觀察現象:兩液面交界處有紫色環產生，表明此樣品為糖類化合物。

2．3．3 FeCl3反應 取1 mg/mL樣品溶液1滴，溶于1 mL乙醇中，加入1%FeCl3醇液1～2滴，以蒸餾水為陰性對照，以蘆丁為陽性對照，觀察現象:樣品溶液顏色無變化，呈陰性，表明樣品中不含酚類物質。

2．3．4 淀粉試驗 取樣品溶液少量，加入1滴碘酒，以淀粉溶液作對照。觀察現象:樣品溶液在加入碘酒后未變藍色，表明樣品中不含淀粉類物質。

2．3．5 硫酸-咔唑反應 取樣品3 mg左右，加水稀釋至200 μL，然后加咔唑-硫酸試劑1．5 mL，混勻，加塞，置于 100℃烘箱中保溫40～45 min，取出冷卻至室溫，以蒸餾水、棉子糖為陰性對照，以半乳糖醛酸為陽性對照，觀察現象:樣品溶液為藍綠色，未顯示紫紅色，表明樣品中不含糖醛酸。

2．3．6 茚三酮試驗 取1 mg/mL樣品溶液1 mL，加入2%茚三酮試劑1mL，加熱煮沸30 s，以蒸餾水為陰性對照，觀察現象:樣品溶液顏色無變化，表明樣品中不含有氨基酸、多肽和蛋白質。

2．3．7 雙縮脲試驗 試劑 A:NaOH的質量分數為0．1 g/mL的水溶液;試劑B:CuSO4的質量分數為0．01 g/mL的水溶液。取1 mg/mL樣品溶液1 mL，加入雙縮脲試劑A 2 mL(必須營造堿性環境)，再加入雙縮脲試劑B 3～4滴，搖蕩均勻，靜置5 min，以蒸餾水為陰性對照，觀察現象:樣品溶液顏色無變化，呈陰性，表明樣品中不含多肽和蛋白質。

2．4 RPO-1樣品總糖的測定

2．4．1 葡萄糖標準品溶液的配制 精密稱取干燥至恒質量的無水葡萄糖對照品50．05mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為500．5μg/mL的標準品溶液，備用。

2．4．2 葡萄糖標準曲線的制備 精密吸取葡萄糖對照品溶液 1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5 mL 于 25 mL 量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，得質量濃度分別為 20．02、30．03、40．04、50．05、60．06、70．07 μg/mL的葡萄糖標準溶液，分別吸取上述葡萄糖標準溶液2．0 mL置于具塞試管中，加5%苯酚溶液1 mL，再加濃硫酸5 mL，搖勻后室溫放置40 min，以蒸餾水作空白對照，在波長490 nm處測定吸收度。以吸收度A為縱坐標，葡萄糖標準品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為 y=0．015 6x+0．017 6(r=0．999 5)，葡萄糖質量濃度在20．02～70．07μg/mL范圍內時，與吸收度呈良好的線性關系。

2．4．3 測定結果 精密稱取RPO-1樣品適量，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取溶液2．0 mL置于具塞試管中，加5%苯酚溶液1 mL，再加濃硫酸5 mL，搖勻后，室溫放置40min，以蒸餾水作空白對照，在波長490 nm處測定吸收度，將其代入回歸方程計算，結果見表1。

表1 RPO-1樣品總糖測定結果

3 討論

3．1 本實驗建立了簡單方便的黃精低聚糖分離純化工藝，并對其理化性質進行了研究，發現樣品中不含酚類物質、淀粉、糖醛酸、大分子蛋白質、多肽和核酸，為今后進一步研究其單糖組成、化學結構和生物活性等提供理論參考。

3．2 苯酚-硫酸比色法測定黃精低聚糖的原理［8］是低聚糖在濃硫酸的作用下，先水解為單糖，迅速脫水形成糠醛衍生物，然后與苯酚縮合為有色化合物，在490 nm處有特征吸收。本實驗在測定總糖時用80%乙醇處理樣品，消除了干擾成分，結果可靠;同時采用苯酚-硫酸法，簡單快速、顯色穩定、靈敏度高、重現性好，生成的顏色持久［9］。通過此法測得其樣品總糖質量分數為91．3%，但是由于糖類物質水解為單糖難易程度不同，故水解條件不同。水解不夠，單糖不能充分釋放出來;水解條件過度，釋放的單糖或有關的糖醛衍生物部分可能會被破壞。因此要嚴格掌握好實驗的操作條件［10］。

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