大黃素甲醚對體外新生大鼠皮質神經元的營養作用

蘇鉅年， 賴永長，皮 婷， 薛小燕， 林煉峰， 羅煥敏，，3*

(1．暨南大學藥學院神經藥理研究室 廣東 廣州510632;2．暨南大學醫學院藥理學系 廣東 廣州510632;3．暨南大學-香港大學腦功能與健康聯合實驗室，廣東廣州510632)

何首烏含有二苯乙烯苷類、蒽醌類化合物等，具有抗氧化、抗衰老、保肝、調節免疫和降血脂等方面的生物學活性［1］。當前何首烏的研究大多都是集中在二苯乙烯苷類化合物的抗氧化和對神經作用的特性上［2］，特別是何首烏的其他主要成分是否具有神經方面作用尚未闡明，大黃素甲醚作為何首烏蒽醌類化合物的成分之一，對腦缺血具有保護作用，提示可對大黃素甲醚的神經元營養作用作進一步研究。本研究采用無血清體外培養原代皮質神經元來觀察大黃素甲醚對皮質神經元的存活及促突起生長的作用，以闡明其是否具有神經營養作用。

1 材料

1．1 藥品與試劑 DMSO(北京鼎國);大黃素甲醚(中國藥品生物制品檢定所);DMEM/F12(美國Gibco);B27添加劑(美國Gibco);多聚賴氨酸(相對分子量7～15萬，美國Sigma);胰蛋白酶(美國Amersco);MTT(美國Sigma);胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技);單克隆兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶(NSE，武漢博士德);單克隆小鼠抗大鼠微管相關蛋白2(MAP2，美國Sigma);牛血清白蛋白(BSA)(博大泰克);即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德);RT-PCR試劑盒(TaKaRa，批號:DRR019A);DNA Marker(TaKaRa);腺苷受體抑制劑 ZM241385(Tocris Bioscience，批號:13A/100775);酪氨酸激酶抑制劑 K252a(美國 Sigma，批號:BCBB3202)，其余試劑、藥品均為國產分析純。

1．2 動物 SPF級健康雌、雄SD大鼠，2～3月齡，體質量約200g，廣東省實驗動物中心，合格證號2007A003。

1．3 主要儀器 SW-CJ-1F型超凈臺(蘇州凈化設備)，IX71倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，24孔板、96孔板(美國Corning)，培養箱(英國Galaxy S)，酶標儀(美國BIO-RAD)。

2 方法

2．1 分離及培養方法 參考 Brewer等的方法［3-5］，取12 h內新生大鼠，75%酒精中浸泡消毒20s。超凈臺內分離出大腦皮質，剝離腦膜并去除海馬，D-hanks中浸洗，將其剪成約1 mm3大小，加入0．25%胰蛋白酶后35℃中消化，10min后用含有10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化。過濾、離心后取得神經元，含0．4%B27的DMEM/F12培養基吹散細胞后用臺盼藍染色并計數活細胞數目，制成所需細胞濃度的均勻細胞懸浮液，在預先用0．1 mg/mL的多聚賴氨酸處理的孔板中接種神經元。接種后于細胞培養箱中培養。

2．2 神經元的鑒定 神經元培養48 h，加入4%多聚甲醛固定，PBS漂洗后加入30%H2O2與純甲醇(1∶50)浸泡20 min，PBS漂洗后滴加山羊血清封閉液，孵育20 min，棄去上清液。加入1∶80的一抗PBS液，4℃濕盒內放置12 h。PBS漂洗，用辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗，室溫放置20 min，PBS漂洗，加入 SABC，置于濕盒中20 min后用PBS漂洗，再用DAB顯色，PBS漂洗后鏡下觀察并拍照。

2．3 MTT比色法檢測細胞活性 0．4%B27的 DMEM/F12培養基制成濃度為8×106細胞/mL的神經元細胞懸液，于預先多聚賴氨酸處理的96孔板中每孔100μL接種，4 h后換液同時加入終質量濃度0．5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4μmol/L大黃酸甲醚，并設定溶媒對照組和質量濃度10 ng/mL bFGF的陽性對照組。置于培養箱，繼續培養96 h后，棄去培養基，每孔加入MTT(5 mg/mL DMEM/F12)100μL，繼續培養4 h后棄清培養液，加入200μL二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩至晶體完全溶解，酶標儀570 nm波長下讀取各孔吸光度值(A)［6］。每個組6個復孔，計算其平均值。

2．4 細胞形態學觀察 大黃素甲醚溶解于DMSO，作用于神經元，使終濃度為1、2、4μmol/L，另設立溶媒對照組和10 ng/mL bFGF陽性對照組。加藥72 h后，在顯微鏡(×400)下觀察各組神經元生長情況，以胞體有光暈、長出突起的神經元為記錄對象，每孔隨機選取12個視野，每組4個復孔。用Image-pro plus6．0圖像分析軟件處理照片，測量出每組神經元平均突起長度［7-9］。

2．5 神經元RNA樣品的制備 大黃素甲醚溶解于DMSO，作用于神經元，使終濃度為1、2、4μmol/L，另設立溶媒對照組和終濃度10 ng/mL bFGF組。培養4 d后，棄去培養液，每組加1 mL TRIzol裂解，再加200μL三氯甲烷混勻，高速離心(10 000×g，15 min)，取其上清液，加等體積異丙醇混勻后離心沉淀(10 000×g，10 min)，加入75%乙醇洗滌沉淀，超凈臺內晾干沉淀，加DEPC水溶解RNA。

2．6 引物的設計與合成 根據Genebank的序列，Primer5．0軟件設計大鼠GADPH和MAP-2的引物(見表1)，引物均委托英濰捷基(上海)貿易公司合成。

表1 大鼠MAP-2和GADPH的引物序列

2．7 測定 參照試劑盒說明書進行神經元MAP-2、GADPH mRNA量的測定、cDNA合成及PCR擴增。

2．8 神經營養作用機制的初步研究 按如下分組:K252a 100 nmol/L，ZM241385 20 nmol/L，大黃素甲醚 2 μmol/L，K252a 100 nmol/L+大黃素甲醚 2μmol/L，ZM241385 20 nmol/L+大黃素甲醚2μmol/L，溶媒對照組。分別作用于神經元，加藥48 h 后按2．4 項方法處理［10-11］。

3 結果

3．1 體外培養大鼠大腦皮層神經元形態學觀察和鑒定 新生大鼠大腦皮層神經元剛接種時胞體較小呈圓形，懸浮并均勻散布;接種4 h后開始貼壁，神經元分布均勻，多數神經元為圓形，少量細胞長出微小的突起。有少量的細胞碎片和紅細胞，更換培養基的方法除去未貼壁的神經元、紅細胞和細胞碎片。培養24 h后有突起的細胞明顯增多，胞體變大，突起延長但仍較短小。培養48 h后，細胞胞體明顯增大，多數呈梭形或圓梭形，每個細胞有2～4個突起，突起長度明顯增加，開始出現神經網格。利用神經元特異性烯醇化酶(NSE)免疫細胞化學鑒定法鑒定接種48h的細胞，結果顯示NSE陽性細胞占絕大多數，見圖1，表明絕大多數細胞(＞97%)是神經元。

圖1 新生大鼠皮質神經元的形態學觀察及鑒定

3．2 不同濃度藥物干預對神經元存活的影響 MTT法檢測顯示，在該培養條件下，大黃素甲醚各劑量組均可顯著提高細胞活性，表明大黃素甲醚能促進神經元的存活(見表2)。

表2 大黃素甲醚對原代皮質神經元活性的影響 ( ± s，n=6)

表2 大黃素甲醚對原代皮質神經元活性的影響 ( ± s，n=6)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

組別 藥物劑量 A值溶媒對照組0．1% 0．088 2 ±0．003 2 bFGF 組 10 ng/mL 0．153 2 ±0．012 3＊＊大黃素甲醚組 0．5 μmol/L 0．100 4 ±0．006 6＊＊1 μmol/L 0．115 8 ±0．008 0＊＊2 μmol/L 0．122 6 ±0．014 4＊＊4 μmol/L 0．124 2 ±0．011 3＊＊

3．3 形態學定量分析 加藥后72 h后，大黃素甲醚各劑量組突起長度明顯增長，與溶媒對照組相比，均有顯著性差異(P＜0．01)，各劑量組與 bFGF組之間無明顯差異(P＞0．18)。見表3，圖2(A ～E)。

表3 大黃素甲醚對培養72 h大鼠大腦皮層神經元突起的影響( ± s，n=4)

表3 大黃素甲醚對培養72 h大鼠大腦皮層神經元突起的影響( ± s，n=4)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

組別 藥物劑量 平均突起長度/μm溶媒對照組0．1% 181．723 1 ±65．600 9 bFGF 組 10 ng/mL 318．551 9 ±72．689 6＊＊大黃素甲醚組 1 μL/mL 273．110 5±51．771 0＊＊2 μL/mL 289．727 8 ±51．791 7＊＊4 μL/mL 268．982 4 ±50．771 5＊＊

3．4 大黃素甲醚對大腦皮層神經元MAP-2 mRNA表達的影響 從表4和圖3中可看出，0．5μmol/L、2μmol/L、4μmol/L大黃素甲醚組MAP-2 mRNA與內參基因GADPH mRNA的含量百分比值較溶媒對照組顯著上升(P＜0．01)。

3．5 神經營養作用機制的初步研究 從表5中看出，K252a 100 nmol/L組或K252a 100 nmol/L+大黃素甲醚2 μmol/L組與溶媒組比較，突起長度無明顯變化(P＞0．05);ZM241385 20nmol/L組與溶媒組比較能縮短突起長度(P＜0．01);大黃素甲醚2μmol/L組或ZM241385 20 nmol/L+大黃素甲醚2μmol/L組與溶媒組比較，能增加突起長度(P＜0．01)，且兩組之間無統計學差異(P ＞0．05)。

A．DMSO溶媒對照組 B．大黃素甲醚1μmol/L組 C．大黃素甲醚2μmol/L組D．大黃素甲醚4μmol/L組 E．bFGF 10ng/mL組 標尺為50μmol/L

表4 大黃素甲醚對大鼠大腦皮層神經元MAP2 mRNA量的影響 ( ± s，n=3)

表4 大黃素甲醚對大鼠大腦皮層神經元MAP2 mRNA量的影響 ( ± s，n=3)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 藥物劑量 MAP-2/GADPH(%)溶媒對照組0．1% 2．34 ±0．12 bFGF 組 10 ng/mL 36．12 ±3．04＊＊大黃素甲醚組 0．5 μmol/L 23．44 ±1．38＊＊2 μmol/L 28．12 ±1．95＊＊4 μmol/L 30．50 ±2．19＊＊

圖3 凝膠電泳圖片

表5 2種抑制劑對48 h大鼠大腦皮層神經元突起的影響( ± s，n=3)

表5 2種抑制劑對48 h大鼠大腦皮層神經元突起的影響( ± s，n=3)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與大黃素甲醚組比較，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 藥物劑量 平均突起長度/μm溶媒對照組 0．2% 100．76 ±15．62##大黃素甲醚 2 μmol/L 158．46±36．81＊＊K252a+大黃素甲醚組100 nmol/L+2 μmol/L 104．27 ±15．91##K252a 100 nmol/L 105．25 ±20．78##ZM241385+大黃素甲醚組20 nmol/L+2 μmol/L 147．15 ±57．53＊＊ZM241385 20 nmol/L 74．10 ±23．85＊＊##

4 討論

中醫認為“腎生髓，腦為髓海”，“腎”與腦功能存在密切的聯系。通過補腎添髓可以防治衰老引起的記憶力下降。何首烏味苦、甘、澀，性溫。歸肝、腎經。《開寶本草》中說其:“益氣血，黑髭鬢，悅顏色。久服長筋骨，益精髓延年不老”。具有補益精血、澀精止遺、補益肝腎的作用。自古何首烏就被當成延年益智的藥物。大黃素甲醚為何首烏的主要成分之一，本實驗觀察大黃素甲醚對體外培養的新生大鼠皮質神經元突起生長及存活的影響。形態學定量分析，細胞活性測定和MAP-2mRNA表達量的測定結果顯示，與溶媒對照組相比，1～4μmol/L組均可以提高細胞活力、促進神經元突起的生長(P＜0．01);bFGF與1～4μmol/L加藥組相比，對神經元突起長度的影響無統計學意義(P＞0．3);MAP2 mRNA電泳顯示，各加藥組和bFGF組與溶媒對照組相比，能明顯增加MAP-2 mRNA表達的量(P＜0．01)，表明大黃素甲醚具有神經營養作用。在形態學分析中，可能是由于4μmol/L組存活的細胞較多，每個細胞生長的空間較少，抑制突觸的生長，以致4μmol/L組比2μmol/L組的平均突起長度略短。

神經營養作用機制的初步研究中發現，加入腺苷受體抑制劑不能阻斷大黃素甲醚促進對神經元突起生長的作用(與大黃素甲醚2μmol/L相比P＞0．05);而加入酪氨酸激酶抑制劑能阻斷大黃素甲醚促進對神經元突起生長的作用(與大黃素甲醚2μmol/L相比 P＜0．01)。提示大黃素甲醚可能是通過直接或間接激活Trk受體起營養作用，而非通過腺苷受體起營養作用。

神經退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、亨廷頓病等，都與神經突起和神經元的丟失相關，主要因為神經元缺乏營養或受到有害物質損傷引起。

內源性神經營養因子家族如NGF、BDNF等，在神經元生長、存活、分化，調節突觸可塑性方面具有重要［12-13］。但外源性神經營養因子缺點也比較突出，如分子量大、不易透過血腦屏障、易引起疼痛等，致使它們在臨床應用過程中受到很多限制。近年研究表明，有神經營養因子類似作用的小分子物質有預防突觸丟失、突起損傷的作用，具有治療神經退行性變的潛力。神經營養作用的小分子物質可以克服神經營養因子的上述缺點，用于治療神經退行性疾病的潛力。大黃素甲醚為小分子中藥單體，脂溶性好，具有一定的神經營養作用，但其作用機制還有待進一步研究。

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