疏肝脂片質量標準研究

李 燕， 晁 愚， 吳威巍， 楊 方， 莊昌龍， 吳 彤*

(1．上海醫藥工業研究院，上海200040;2．上海方心健康科技發展有限公司，上海200032)

疏肝脂片源于臨床經驗方舒肝祛脂膠囊，由柴胡、三七、枳實、白術等九味中藥組成，具有疏肝消脂、清熱化積、行氣活血的功效，用于治療非酒精性單純性脂肪肝。為有效控制該制劑的質量，本實驗按照中藥六類新藥的注冊要求對該制劑進行質量研究。柚皮苷為枳實中的主要有效成分，具有降血脂、抗動脈粥樣硬化的生物學活性，能降低膽固醇、減少血栓的形成［1-3］，并且在該制劑中含有量較高，因此采用高效液相色譜法測定其質量分數，同時對柴胡、三七、白術進行定性鑒別。實驗方法簡單可靠，為該制劑質量標準的制定提供了依據。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 HP1100高效液相色譜儀(G1322A脫氣機，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314AVWD檢測器，美國HP公司);KQ2200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);HHS電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械二廠);BP211D型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1．2 試藥 疏肝脂片(批號080625-1，080625-2，080625-3，上海醫藥工業研究院自制);柚皮苷對照品(批號110722-200610，供定量測定用);人參皂苷 Rg1(批號 110703-200424，供定量測定用);柴胡對照藥材(批號 120992-200504);白術對照藥材(批號120925-200407)，上述對照品及對照藥材均購自中國藥品生物制品檢定所;柴胡皂苷C對照品(批號080314，上海醫藥工業研究院自制，純度﹥98%);乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2．1 柴胡 取本品10片，研細，過75目篩，稱取粉末0．35 g，加甲醇10mL，超聲提取10min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL超聲使成懸濁液，轉移至分液漏斗中，以水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取柴胡對照藥材0．1 g，加甲醇10mL，超聲處理10min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為對照藥材溶液;取柴胡皂苷C對照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的溶液，作為對照品溶液。再取缺柴胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法(2010版中國藥典一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(10∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，60℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無斑點。結果見圖1。

圖1 疏肝脂片中柴胡薄層色譜圖

2．2 三七 取本品10片，研細，過75目篩，稱取粉末0．35 g，加甲醇10mL，超聲提取10min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL超聲使成懸濁液，轉移至分液漏斗中，以水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的溶液，作為對照品溶液。再取缺三七的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法(2010版中國藥典一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，晾干，噴以10%硫酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無斑點。結果見圖2。

圖2 疏肝脂片中三七的薄層色譜圖

2．3 白術 取本品10片，研細，過75目篩，稱取粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL超聲使成懸濁液，轉移至分液漏斗中，以三氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加0．5 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。另取白術對照藥材0．1 g，加甲醇10 mL，80℃水浴回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為對照藥材溶液。再取缺白術的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照高效液相色譜法(2010版中國藥典一部附錄Ⅵ D)試驗，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑;乙腈-水(45∶55)為流動相;檢測波長為210 nm，體積流量1mL/min，柱溫25℃。吸取上述3種溶液各20μL，注入液相色譜儀，測定，供試品色譜中，應呈現與對照品色譜峰保留時間相同的色譜峰，陰性對照無該色譜峰。結果見圖3。

3 定量測定

3．1 色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-水(20∶80)為流動相;檢測波長為283 nm［4-7］，體積流量1 mL/min，柱溫25℃。理論板數按柚皮苷峰計算應不低于5 000。結果見圖4。

3．2 供試品溶液的制備 取本品10片，研細，過75目篩，取粉末約35 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇約9 mL，超聲提取20 min，放冷至室溫，再加50%甲醇至刻度，濾過，取續濾液，即得。

3．2 供試品溶液的制備 取本品10片，研細，過75目篩，取粉末約35 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇約9 m L，超聲提取20 min，放冷至室溫，再加50%甲醇至刻度，濾過，取續濾液，即得。

圖3 白術定性鑒別的HPLC圖譜

圖4 柚皮苷定量測定的HPLC圖譜

3．5 標準曲線的制備 精密吸取柚皮苷對照品溶液(0．337mg/mL)適量，以 50% 甲醇分別稀釋至 0．168、0．084 2、0．042 1、0．003 37 mg/mL，分別精密吸取上述溶液 20 μL 注入液相色譜儀，測定，以質量濃度對峰面積進行回歸，得回歸方程為 Y=3．72 ×104X-43．6，r=0．999(n=5)，表明柚皮苷進樣量在0．067 4μg～6．74μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

3．6 精密度試驗 精密吸取質量濃度為0．084 2 mg/m L的柚皮苷對照品溶液20μL，注入液相色譜儀，重復進樣6次，測定，柚皮苷峰面積的RSD為0．22%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3．7 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液，分別在0、2、4、8 h進樣20μL，測定，柚皮苷面積RSD為2．2%，表明供試品溶液中柚皮苷在8 h內穩定。

3．8 重復性試驗 取同一批號的樣品6份，制備供試品溶液并測定，柚皮苷的RSD為0．96%，表明該試驗方法的重復性較好。

3．9 加樣回收率試驗 取同一批號的樣品6份，分別加入一定量的柚皮苷對照品，制備供試品溶液，精密吸取20μL注入液相色譜儀，測定柚皮苷，計算加樣回收率，柚皮苷回收率平均值為98．6%，RSD為2．2%，說明該測定方法回收率較好，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

3．10 樣品的測定 取3批片劑(批號080625-1，080625-2，080625-3;平均片質量分別為 370．81 mg，370．67 mg，370．33 mg)，每批取2個樣品，制備供試品溶液，測定柚皮苷量，3批樣品中柚皮苷量分別為 8．64 mg/片、8．60 mg/片、9．18 mg/片。

4 討論

4．1 柴胡的鑒別方法參考2010版中國藥典［8］263，考察不同比例的展開劑，包括乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)，乙酸乙酯-乙醇-水(8 ∶2 ∶1)展開兩次，乙酸乙酯-乙醇-水(10 ∶2 ∶1)等。實驗結果證明，后兩種展開方法均有較好的展開效果，但是乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)需要展開兩次，所用時間較長，因此，選擇乙酸乙酯-乙醇-水(10 ∶2 ∶1)。

4．2 三七的鑒別方法使用了多種展開劑，包括正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1 ∶5)、三氯甲烷-甲醇-水(13 ∶7 ∶2)下層溶液［9］、三氯甲烷-甲醇-水(13 ∶6 ∶2)下層溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10)下層溶液［8］11等。實驗結果證明，3種展開劑均有較好的分離效果，但是由于正丁醇-乙酸乙酯-水系統背景顏色較深，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水系統不穩定，因此選擇三氯甲烷-甲醇-水系統，其中三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)下層溶液展開效果更好，故最終選擇三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)下層溶液作展開劑。

4．3 實驗中曾采用多種提取方法制備白術鑒別的供試品溶液，更換不同的展開系統，均未找到合適的鑒別白術的薄層層析方法，因此，選擇用高效液相色譜法對白術進行鑒別［10-11］。

4．4 實驗中對柚皮苷的提取時間進行考察，10 min、20 min、30 min柚皮苷的提取率分別為 2．89%、2．91%、2．92%，確定20 min可將柚皮苷提取完全，因此選擇超聲提取20 min。

［1］楊宏亮，田 珩，李沛波，等．柚皮苷及柚皮素的生物活性研究［J］．中藥材，2007，30(6):752-754．

［2］楊曉泉，張海德，李 琳．柚皮黃酮類抗氧化物質的純化及其降血脂作用研究［J］．營養學報，2004，26(5):378-381．

［3］蔡逸平，曹 嵐，范崔生．枳實、枳殼類藥材的化學成分及藥理研究概況［J］．江西中醫學院學報，1999，11(1):18-19．

［4］梁遠園，馮 彪，祝晨筱，等．HPLC法測定枳實藥材中橙皮苷和柚皮苷的含量［J］．中藥新藥與臨床藥理，2006，17(5):359-361．

［5］吳衛中，李永慶，陳 蕾．RP-HPLC法測定金甲王顆粒中柚皮苷的含量［J］．藥物分析雜志，2007，27(7):1078-1080．

［6］劉振麗，宋志前，李林福，等．枳實炮制前后化學成分含量的變化［J］．中成藥，2006，28(8):1148-1150．

［7］曾祖平，何 薇，崔立山．高效液相法測定枳實中黃酮類成分［J］．中國實驗方劑學雜志，2006，12(7):9-10．

［8］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010版一部［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010．

［9］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2000版一部［J］，北京:化學工業出版社，2000:10．

［10］苗明三，李振國．現代實用中藥質量控制技術［M］．北京:人民衛生出版社，2000:334．

［11］葉 燕，程雪梅，侴桂新．白術藥材HPLC指紋圖譜研究［J］．江蘇中醫藥，2009，41(4):59-60．