聯合蛋白質組學和代謝組學探討兔脊髓缺血再灌注損傷的時間規律

苑福升 ，劉 健 ，高 琦 ，朱本清 ，王海濤 ，閆 鵬 ，楊小玉

1.吉林大學中日聯誼醫院骨科，吉林長春 130021；2.天津人民醫院骨科，天津 300211

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱脊髓外科領域研究的熱點，以往的研究主要集中在闡述機制、解釋空間構造方面。我們建立蛋白組學和代謝組學聯合研究平臺，試圖從新的角度闡釋脊髓缺血再灌注損傷時間規律。

1 蛋白組學方法

1.1 儀器

Amersham公司IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Twelve電泳系統、蛋白核酸分析儀、超聲破碎儀。Beckman冷凍離心機，PROTEAN IEF cell型等電聚焦儀、PROTEAN-11(R)ⅪCell型垂直電泳槽、凝膠成像系統為Bio-Rad產品，Thermo冷凝水循環儀質譜儀，Applied Biosystems產品ABI-4800型反射式基質輔助激光解吸附飛行時間串聯質譜，Typhoon 9410掃描儀及圖像分析軟件DeCyder v.5.02（Amersham Bioscience）。

1.2 試劑

Cy2、Cy3、Cy5熒光染料購自Amersham公司；DMF購于SIGMA 公司；裂解液（7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4%CHAPS）、水化液（8 mol/L尿素、2%CHAPS）、平衡母液（6 mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCl、20%甘油、2%SDS）、RCDC 定量試劑盒、10× 電 泳 緩 沖 液 （250 mmol/L Tris、1.92 mol/L glycine、1%SDS）、Bradford定量試劑盒、30%丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=29∶1）、1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、10%SDS 均是Bio-Rad公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備和脊髓標本采集 清潔級健康成年新西蘭大白兔由吉林大學實驗動物中心提供，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg。隨機將實驗動物分3組：假手術組（I0R0）、缺血30 min組（I30R0）、缺血再灌組（I30R6、12、24、48），每組 6 只。 將其用10%的水合氯醛麻醉，開腹后用血管夾在左腎動脈分叉下阻斷腹主動脈，使脊髓腰骶段缺血。假手術組和缺血30 min組于術后麻醉下取脊髓L4～5節段，缺血再灌注組缺血30 min后去除血管夾閉創，模擬再灌注。再灌注6、12、24、48 h麻醉下活體取脊髓L4～5節段。液氮速凍-70℃冰箱保存。

1.3.2 樣品制備 液氮研磨組織粉末，按1∶10（W/V）加入lysis buffer。 加蛋白酶抑制劑（Cocktail） 20 μl/ml。 先取一部分lysis溶解樣品粉末，轉入Dounce勻漿器中。用剩余buffer清洗容器，再轉入Dounce勻漿器中勻漿。將樣品放入冰水混合物燒杯里超聲，21%振幅。累計超聲60 s，超0.2 s，停1 s（pulse on 0.2，off 2）， 室溫提取 30 min。 離心，40 000 g×1 h/s，4℃離心，取上清，測量出蛋白濃度后，分裝保存在-80℃冰箱。

1.3.3 實驗方法 標本提取、標記及電泳過程詳見文獻[1]。

1.3.4 圖像掃描及分析 電泳結束后，掃描儀在488/520 nm，532/580 nm，633/670 nm 波長分別對 Cy2、Cy3、Cy5 熒光染料標記的圖像進行掃描。用DeCyder v.5.02圖像分析軟件觀察各蛋白點在缺血和再灌注各時間點的變化，取正常組與缺血再灌注24 h組比較篩選差異點標記描述。

1.3.5 差異點的質譜鑒定 應用膠內酶切法切取差異點。質譜分析采用反射式掃描方式，掃描范圍：700～4000Da；激光能量：一級質量分析器5000 v，二級質量分析器 5 500 v。

1.3.6 數據庫檢索 數據庫應用兔形目數據庫和NCBI全庫。兔形目數據庫取蛋白質評分＞52分，NCBI全庫取蛋白質評分＞67分，置信水平在95%以上。

1.4 結果

選取實驗動物I30R24組相對于對照組I0R0組，2倍的差異結果作為入選對象，通過熒光標記比較結果，共選取了49個差異點，通過MALDI-TOF-TOF/MS分析酶解后肽碎片的一級和二級離子序列。最后基于MASCOT算法的檢索平臺，分別以NCBI的兔蛋白庫和物種全蛋白庫分別檢索，最終獲得了21個蛋白質。根據灌流過程中蛋白質表達量的變化，實驗中所設定的取樣組（0、6、12、24 和 48 h）繪制變化曲線，見圖 1。

1.5 Western-blot驗證分析

選取了24 h下調蛋白質α-tubulin進行驗證結果分析，電泳上樣次序根據缺血后灌注的時間順序，與蛋白質分析曲線序列完全一致。

2 代謝組學方法

2.1 材料與方法

2.1.1 主要儀器與裝置試劑

氣相色譜-飛行時間質譜儀（GC-TOF-MS）：美國Waters公司產品；DB-5MS 柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）安捷倫科技有限公司產品；離心機為德國Eppendorf公司產品；電子分析天平（BS124S）為德國Startorius公司產品，Masslynx 4.0數據處理系統，英國Micromass公司產品；Nist 02數據庫。

2.1.2 主要試劑

核糖醇（內標）：由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、正己烷（色譜純）：Merck公司產品；其他標準試劑均為國產。分析純實驗用水為Milli-Q超純水系統（美國Milipore公司）純化的純凈水。

2.1.3 實驗動物與處理

同蛋白質組學研究組實驗新西蘭兔，隨機分為3組：第1組為正常假手術組 （I0R0，K），第2組為脊髓缺血30 min（I30R0，M）， 第 3 組缺血 30 min， 再灌注 24 h 組（I30R24，H）。復制動物模型同前。分別于假手術后，缺血30 min及再灌注24 h采集門靜脈血，用1%肝素鈉抗凝，3 000×g離心10 min后，取血漿-20℃保存待測。

2.1.4 實驗條件

2.1.4.1 色譜條件：色譜柱：DB-5MS（30.00 mm×0.25 mm,0.25 μm）；升溫程序：柱初溫50℃,以30℃/min升溫至160℃，保持1 min，以4℃/min升溫至240℃，保持1 min；以30℃/min升溫至280℃，保持 3 min；進樣溫度 260℃；載氣為超純氦（99.9996%），柱流量（恒流）：1 ml/min；進樣量 0.3 ml。

2.1.4.2 質譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250℃，離子源溫度220℃，電離方式EI+，檢測質荷比范圍：50～800 m/z。

2.1.4.3 多維統計分析結果：試驗中采用非監督的主成分分析（PCA）對K、M和H組的血清代謝物進行分析，建立二維PCA數學模型OPLS-DA模型的載荷圖。

2.2 結果

采用氣相色譜聯合質譜分析（GC-MS）的方法分析測定血清中代謝物并用PCA、OPLS-DA等多維統計方法區分假手術組和不同時段（30 min，24 h）缺血再灌注損傷組。結果發現了51種差異代謝物物質組成的代謝標志物組 （其中一個為內標物）。代謝產物的成分及對比差異詳見表1、2。

表1 假手術組（K）、術后24 h組（H）比較

表2 術后30 min組（M）與術后24 h組（H）比較

代謝產物主要分為糖類、氨基酸、脂類等。K組和H組對照，代謝產物偏高主要集中在半乳糖、未知糖、甘油、硬脂酸、6-脫氧吡喃甘露糖、軟脂酸、尿素、肌醇；M和H組對照，代謝產物偏高主要集中在：葡萄糖、半乳糖、軟脂酸、尿素、甲氧基丙二酸、甘氨酸、硬脂酸、5-氧基脯氨酸。

3 討論

建立和完善蛋白質組學和代謝組學技術平臺，可從蛋白組、代謝組兩個水平檢測目的樣品的非期望效應，非選擇性、無偏倚的方式篩選出被研究對象在細胞或組織水平的病理生理或代謝水平的潛在變化[2]。

DIGE在差異蛋白質分析方面穩定、可靠。在數據庫檢索上，借鑒Vissers等[3]的經驗，采用兔形目數據庫和NCBI全庫進行互補分析的策略。分時段采樣的蛋白質差異表達的結果上獲得若干組動態的變化曲線，變化趨勢顯示，損傷的24 h是主要改變關鍵點，在此前后蛋白質的表達水平基本一致。

重點神經蛋白質如神經纖維蛋白M （neurofilament M,NFM），在上調和下調模式中均出現，其在應激后受雌二醇的誘導表達以恢復神經細胞的功能[4]，損傷前期該蛋白質表達下降，而后保護性地上升以恢復神經元的功能，因此推測，保護性機制發生于再灌注24 h。另一個神經蛋白是span2，該蛋白參與神經元膜的穩定性的保持，Indraswari等以腦缺血小鼠為模型發現spna2的mRNA表達上調，參與缺血保護[5]。在結果中其蛋白質表達水平在24 h明顯下調，表明該蛋白在缺血損傷前期發揮不同的作用。

膠質纖維酸性蛋白（GFAP）24 h表達量下降，之后表達水平恢復。膠質纖維酸性蛋白被認為是脊髓損傷的標志性蛋白。

根據實驗結果構建的數學模型顯示，蛋白表達量變化總體趨勢呈現24 h“瀑布式”下降，而其余時間點變量很小的特征，Woolf等也通過免疫組化分析周圍神經損傷時觀察到，糖原磷酸化酶（PYGM）在24 h表達有一個瞬時降低[6]，因此推測在脊髓損傷中，糖代謝的酶表達水平的降低可以在一定程度上降低葡萄糖的消耗，使體內的葡萄糖維持在較高水平，從而保護急性應激中受損的神經。

保守的熱休克蛋白（HSP）是細胞對缺血、缺氧等應激反應敏感而可靠的標記，對應激細胞起保護作用[7]。最近有實驗證實，脊髓損傷組大鼠在脊髓損傷后2 h即有HSP70開始表達，并隨著時間增加，表達24 h達到峰值，維持至72 h后表達漸少，低于6 h水平[8]，與HSP相關的輔助因子熱激活蛋白70識別蛋白A（HSC70）在24 h下降達到低谷而后升高，此過程表明初期應激后機體內在損傷保護機制啟動，與HSP70聯動，其誘導的數量與保護作用的強弱呈正相關[9]。

琥珀酸脫氫酶、烯醇酶等參與碳水化合物代謝和能量代謝的酶類在24 h時間點上也呈現下降的特征，但是目前仍缺少其在神經損傷研究中的作用機制證據。

代謝組學方面，由于所檢測的許多內源性小分子化合物直接參與了體內各種代謝、循環，其水平高低在一定程度上反映了機體生化代謝的功能和狀態，通過代謝網絡分析還能了解體內生化代謝狀態，溝通生化代謝與疾病關系[10]。氣質聯用（GC-TOF/MS）在掃描模式下不但具備了廣譜測定、強大的分離和分析復雜混合物的能力，還擁有很高的靈敏度、良好的重現性和線性響應[11-12]可以同時測定定性幾百個化學性質不同的化合物。其龐大的化合物譜圖庫也極大地方便了未知化合物的鑒定。

代謝產物分析方面，高能磷酸化合物，如磷酸肌酸（P2Cr）、三磷酸腺苷（ATP）的耗竭及葡萄糖、糖原的耗竭被認為是缺血性損傷最敏感和最可靠的代謝指標。葡萄糖在細胞內轉換為丙酮酸后，缺氧時氧化磷酸酶活力下降，糖酵解產生的H＋與丙酮酸結合形成乳酸，其作為疲勞物質，量的升高可以在某種程度上反映細胞缺血缺氧的狀態。本試驗中假手術組（K）、術后 30 min 組（M）、術后 24 h 組（H）比較：在假手術組與術后24 h組比較中（表1），出現明顯高峰的產物，假手術組為葡萄糖，術后24 h組為乳酸，說明葡萄糖消耗明顯。而術后30 min組與術后24 h組比較（表2），術后24 h出現半乳糖與未知名稱的糖明顯較術后30 min組高。半乳糖也可以通過半乳糖激酶等作用下進入酵解途徑。其他糖類如6-脫氧吡喃甘露糖也可通過變位酶轉變成磷酸己糖而半乳糖激酶等作用下進入酵解途徑。其他糖類如6-脫氧吡喃甘露糖也可通過變位酶轉變成磷酸己糖而進入酵解途徑，由此可推斷在術后24 h中，糖代謝已經達到峰值，趨向于向正常方向回歸正常代謝變化。此外甘油是細胞膜的組成部分，研究表明甘油的濃度變化可能反映細胞膜損傷的程度[13]。

綜上所述，通過對缺血再灌注損傷兔模型蛋白質組和代謝組的分析，筆者認為，脊髓缺血再灌注后的24 h是關鍵性變化點，神經蛋白部分受損嚴重，影響模型動物的神經支配運動能力。在這種狀態下機體應激啟動了相關的保護機制，主要以降低糖代謝酶類來維持相當水平的血糖濃度，同時為了對受損蛋白質進行修復和重疊以恢復其功能，機體啟動熱激活蛋白等相關修復的因子。而代謝產物中，葡萄糖及其他多種己糖在缺血再灌注損傷24 h的時候，達到代謝的峰值，逐漸開始趨向于向正常方向，回歸正常代謝變化。

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