多西他賽聯(lián)合奧沙利鉑誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

田殿鋒，郭建昇 *，肖 虹，張艷梅

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院普外科，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科，山西太原 030001；3.山西省汾陽(yáng)醫(yī)院ICU科，山西汾陽(yáng) 032200

胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)年發(fā)病率約為60/10萬(wàn)，病死率約為30/10萬(wàn)，居所有惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的第1位[1]。同其他實(shí)體腫瘤一樣，手術(shù)切除是尋求根治的主要手段，但僅有30%~50%的患者可獲得根治性切除，且長(zhǎng)期預(yù)后并不滿意[2]，故近年來(lái)輔助化療已成為除手術(shù)外胃癌的另一重要治療手段。大量臨床資料表明，多西他賽（TAX）與奧沙利鉑（OXA）聯(lián)合治療多種類型的腫瘤時(shí)都有較高的療效，但在體外誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的研究國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。本研究旨在探討多西他賽（TAX）與奧沙利鉑（OXA）聯(lián)用是否可以增強(qiáng)對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。TAX為深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，OXA為成都長(zhǎng)青制藥有限公司產(chǎn)品。RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，CCK-8試劑盒為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鈣熒光探針Fluo-3/AM為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技有限公司，活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞鑒別試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度、每隔2~3天用0.25%胰酶消化傳代一次。

1.2.2 藥物干預(yù)分組 根據(jù)公式，臨床藥物血漿峰值濃度（PPC）（mg/L）=[臨床用藥量 （mg/m2）×平均體表面積/平均體重]×100/60，結(jié)合臨床藥物常用劑量計(jì)算出每種藥物的PPC值，再參考有關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，確定各實(shí)驗(yàn)組每種藥物的濃度。TAX 組：2.5、5、10、20、40 mg/L，OXA 組：5、10、20、40、80 mg/L，聯(lián)合組：以相應(yīng)的TAX濃度和OXA濃度聯(lián)合應(yīng)用。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)不同濃度單藥及聯(lián)合用藥處理后SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的SGC-7901細(xì)胞用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)濃度至2×104cells/ml接種于96孔板內(nèi)，100 μl/孔。待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組為不加細(xì)胞而只加培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入80 μl含有不同濃度的單藥或聯(lián)合藥物，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入 CCK-8 20 μl混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定A值，所用波長(zhǎng)450 nm，計(jì)算各復(fù)孔吸光度的平均A值，作為試驗(yàn)組或?qū)φ战M的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（空白對(duì)照組 A均值-實(shí)驗(yàn)組 A均值）/空白對(duì)照組 A均值×100%。

1.2.4 中效濃度（Dm）及合用指數(shù)（CI）的計(jì)算 根據(jù)中效原理（Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法）[5-6]，應(yīng)用中效方程式計(jì)算來(lái)判斷兩種藥物之間相互作用的效果。中效方程式為fa/fu=（D/Dm）m，其中fa為藥物作用效應(yīng)（即抑制率），fu為存活率，fu=1-fa；D為藥物濃度，m為斜率；Dm為中效濃度IC50。根據(jù)抑制率及其濃度，繪出趨勢(shì)直線，求出直線回歸方程，計(jì)算出兩藥單用及合用時(shí)的Dm和m，然后算出兩藥的合用指數(shù)（Combination Index，CI）：CI=D1/D×1+D2/D×2+α（D1D2/D×1D×2）。 D1、D2為兩藥合用時(shí)產(chǎn)生×效應(yīng)時(shí)兩藥各自所需濃度，Dx1、Dx2為兩藥單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生×效應(yīng)時(shí)兩藥各自所需濃度。當(dāng)兩藥作用機(jī)制一致時(shí)，α=1；不一致時(shí)，α=0。CI＜1兩藥合用時(shí)產(chǎn)生協(xié)同作用；CI=1 相加；CI＞1 拮抗。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104cells/ml加入內(nèi)置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的劑量分別加入不同濃度的TAX、OXA，單用或合用24 h后終止培養(yǎng)，用PBS液漂洗細(xì)胞2～3次，加入終濃度為10μmol/L Fluo-3/AM應(yīng)用液，在37℃下避光孵育60 min。置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，可在525 nm處探測(cè)到熒光發(fā)射，取得最大熒光信號(hào)后，采用IDQ軟件對(duì)選定的區(qū)域進(jìn)行熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)輸入到Excel 2010作進(jìn)一步分析處理。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×104cells/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的劑量加入不同濃度的TAX、OXA，單用或合用經(jīng)相應(yīng)的時(shí)間作用后收集給藥組及對(duì)照組細(xì)胞，PBS 洗滌 2～3 次。 離心收集 1×105細(xì)胞，加入 500 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入 10 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CellQuest軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并計(jì)算細(xì)胞凋亡率SGC-7901細(xì)胞經(jīng)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的藥物濃度單用或合用作用24 h后，收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞2次，配成濃度為5×105cells/ml的細(xì)胞懸液，取 1 μl的 Mixed Dyes Reagent與25 μl細(xì)胞懸液混勻后，吸取10 μl混勻后細(xì)胞懸液涂片，在熒光顯微鏡下觀察300個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞（VN）、早期凋亡細(xì)胞（VA）、晚期凋亡細(xì)胞（NVA）和死細(xì)胞（NVM）數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同藥物對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用

TAX、OXA以及兩者聯(lián)合，三組分別對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞作用24 h后的細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行比較，結(jié)果表明，各組同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率不同，隨濃度升高，增殖抑制率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TAX與OXA聯(lián)合組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于單藥組（P＜0.05），見(jiàn)表1（表中濃度分組1代表TAX組：2.5 mg/L，OXA 組：5 mg/L，聯(lián)合組：TAX 2.5 mg/L+OXA 5 mg/L；分組 2代表 TAX 組：5 mg/L，OXA 組：10mg/L，聯(lián)合組：TAX 5 mg/L+OXA 10 mg/L；其余分組以相同方式進(jìn)行）。根據(jù)中效方程式計(jì)算 TAX 24 h對(duì) SGC-7901細(xì)胞的 IC50值為 21.9 mg/L；OXA 24 h的IC50值為31.5 mg/L；聯(lián)合時(shí) 24 h的IC50值為8.74/13.68 mg/L。CI=0.42，提示兩藥有協(xié)同作用。

表1 不同處理24 h后細(xì)胞增殖抑制率（ ±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s,n=6)

表1 不同處理24 h后細(xì)胞增殖抑制率（ ±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s,n=6)

注：與 TAX 組比較，aP＜0.05；與 OXA 組比較，bP＜0.05

濃度分組 抑制率（%）TAX組 OXA組 TAX+OXA組12345 17.08±7.21 21.15±5.92 26.68±7.93 39.35±5.26 47.24±3.87 20.37±7.86a 25.25±9.27a 30.37±6.57a 41.83±4.63a 48.72±7.11a 30.65±7.24b 36.45±6.32b 45.08±5.39b 47.97±4.94b 61.52±5.27b

2.2 細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度變化

正常細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度相差達(dá)100 000倍[7]。胞外鈣內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫(kù)動(dòng)員形成的鈣震蕩（鈣峰或鈣波）在各種生理過(guò)程中起重要作用。病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷將造成一系列代謝紊亂，直至細(xì)胞壞死或凋亡。檢測(cè)結(jié)果顯示見(jiàn)表2。SGC-7901細(xì)胞經(jīng)TAX和OXA單用及合用24 h后，與空白對(duì)照組相比Ca2+熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.05）。

2.3 不同處理24 h后各組細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SGC-7901細(xì)胞經(jīng)TAX和OXA單用及合用24 h，對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡見(jiàn)表3。兩藥合用組無(wú)論與對(duì)照組或單用組相比，其誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡率的升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）。

表2 不同處理24 h后各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度（ ±s）Tab.2 Ca2+fluorescence intensity of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

表2 不同處理24 h后各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度（ ±s）Tab.2 Ca2+fluorescence intensity of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

空白對(duì)照組TAX組OXA組TAX+OXA組組別 藥物濃度-10 mg/L 20 mg/L 10 mg/L+20 mg/L Ca2+熒光強(qiáng)度18.97±2.35 312.50±25.30*387.63±26.05*562.59±19.60*

表3 不同處理24 h后各組細(xì)胞凋亡率比較（ ±s）Tab.3 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

表3 不同處理24 h后各組細(xì)胞凋亡率比較（ ±s）Tab.3 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01

空白對(duì)照組TAX組OXA組TAX+OXA組組別 藥物濃度-10 mg/L 20 mg/L 10 mg/L+20 mg/L凋亡率（%）2.03±1.05 11.61±3.06a 13.37±2.51a 28.24±4.11a

2.4 TAX和OXA誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡

熒光顯微鏡下觀察：對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，核質(zhì)體被均勻染成綠色，藥物作用組出現(xiàn)形狀不規(guī)則的綠色早期凋亡細(xì)胞、橙色的晚期凋亡細(xì)胞和呈橢圓形的橙黃色繼發(fā)壞死細(xì)胞，與對(duì)照組細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核碎裂成點(diǎn)狀，可見(jiàn)胞質(zhì)芽狀突起，且隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的比例逐漸增多。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，不同處理組24 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率（表4），與流式細(xì)胞儀下檢測(cè)的凋亡結(jié)果基本吻合。

表4 不同處理24 h后SGC-7901細(xì)胞凋亡數(shù)（個(gè)）Tab.4 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of SGC-7901 cells after 24 h

3 討論

胃癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤之一，盡管在診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，但進(jìn)展期胃癌的預(yù)后仍然很差，不能手術(shù)或術(shù)后轉(zhuǎn)移的胃癌，給予化療聯(lián)合最佳支持治療與單純最佳支持治療相比，生存期和生活質(zhì)量方面均具有益處[8-9]。體外研究證明，很多抗癌藥物的抗腫瘤作用不是直接殺傷腫瘤細(xì)胞而是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或兩種方式并存[10]，由于藥物殺傷腫瘤細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，產(chǎn)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，所以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡成為治療腫瘤的理想方法。目前已經(jīng)有多種促凋亡的藥物，其中化療藥物是主要的促細(xì)胞凋亡的藥物。

多西他賽是一種新型抗腫瘤藥物，屬于紫杉類，其作用機(jī)制是促進(jìn)微管蛋白聚合和阻止微管解聚，從而抑制癌細(xì)胞有絲分裂和增殖。在抑制微管解聚方面，其作用是紫杉醇的2倍，與微管蛋白有更強(qiáng)的親和力，血漿半衰期更長(zhǎng)，藥物在細(xì)胞內(nèi)潴留時(shí)間更長(zhǎng)[11]。奧沙利鉑是1，22-二氨基環(huán)己烷鉑類的水溶性衍生物，是第三代鉑類廣譜抗瘤藥，其主要作用機(jī)制是通過(guò)DNA-復(fù)合體的形成來(lái)介導(dǎo)的[12]。和第一代的鉑類藥物相比具有更強(qiáng)的抗瘤作用，能夠引發(fā)細(xì)胞的DNA一級(jí)和次級(jí)損傷，造成惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，在相同藥物濃度下，聯(lián)合用藥組對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用明顯強(qiáng)于相應(yīng)單藥組，在同一作用時(shí)間點(diǎn)，低濃度TAX和OXA合用，取得了與單藥高濃度組相近或更高療效，減少了單藥用量，降低高濃度化療藥帶來(lái)的較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。CCK-8實(shí)驗(yàn)示兩藥合用指數(shù)（CI）小于1，表明兩藥間存在協(xié)同作用。通過(guò)流式細(xì)胞儀技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞鈣超載以及細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，證明TAX和OXA對(duì)SGC-7901細(xì)胞均具有誘導(dǎo)凋亡的作用。兩藥合用時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯提高，可見(jiàn)TAX和OXA具有協(xié)同誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用。

總之，本研究證實(shí)了TAX與OXA聯(lián)合用藥的合理性，為臨床設(shè)計(jì)高效低毒的胃癌化療方案提供實(shí)驗(yàn)資料。

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