結締組織生長因子、血管內皮生長因子、缺氧誘導因子-1α在胰腺癌中的表達及臨床意義

鄭 剛，劉建生，智仁厚

山西醫科大學第一醫院普外科，山西太原 030001

“腫瘤微環境”的概念由美國Anderson腫瘤研究中心的Ioannides和匹茲堡大學的Whiteside第一次正式提出[1]，腫瘤發生、發展過程中所處的內環境除了有各種因子的相互作用外，由于腫瘤的快速增長，耗氧較多，從而形成了一個缺氧的微環境。結締組織生長因子（connective tissue growth factor,CTGF/CCN2）是1991年Bradham等應用血小板源性生長因子抗體篩選人類臍靜脈內皮細胞cDNA文庫時首次發現，可與多種因子相互作用，在細胞的增殖、黏附、遷移以及血管生成、炎癥反應和組織重構等過程中發揮重要的調節作用。目前在胰腺癌中的作用還不明確，尤其是其在體內和體外環境中對胰腺癌細胞的作用爭議較大。可能與胰腺癌特殊的腫瘤微環境有關。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促血管生成重要的因子之一，在很多病理生理情況下的血管形成中發揮重要作用。缺氧誘導因子-1（laypoxia.inducible factor-1,HIF-1）在腫瘤的抗缺氧代謝中起中樞紐帶的作用。本研究通過免疫組化技術檢測胰腺癌和癌旁正常組織中CTGF、VEGF、HIF-1α的表達情況，探討其相互關系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集山西醫科大學第一醫院普外科2003年1月～2009年12月行手術切除的胰腺癌標本46例，經病理診斷均為導管腺癌。其中，男22例，女24例；年齡31～77歲，平均（58.23±10.31）歲。術前均未接受放化療，臨床資料完整。另取10例癌旁胰腺組織作為對照。

1.2 方法

標本經福爾馬林固定，石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm，HE染色復述病理組織學特征，再進行Envision兩步法免疫組化染色，光鏡觀察。用已知胰腺癌陽性切片做陽性對照，用0.05%PBS液代替一抗作陰性對照。一抗CTGF（sc-14939 Santa Cruz產品），及其對應二抗兔抗羊PV9003（Santa Cruz產品）；一抗VEGF、二抗鼠抗兔 PV6001、染色試劑盒均購自北京中衫公司；一抗HIF-1α購自北京博奧森公司。經預實驗，三者的最佳濃度均調至1∶100，CTGF用EDTA液高溫高壓修復2.5 min，VEGF、HIF-1α用枸櫞酸鈉液高溫高壓修復2 min，其余步驟均按使用說明書進行操作。

1.3 結果判斷

CTGF、VEGF、HIF-1α的陽性判斷為細胞漿出現棕黃色顆粒。400倍鏡下任取5個視野，在雙盲條件下，由2名病理科主任醫師對切片進行觀察，結果判定采用半定量積分分級。采用胡驍的標準[2]，標準如下，

①染色強度：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。②陽性細胞數：0分為陽性細胞占0%，1分為25%，2分為 26～50%，3分為 51～75%，4分為＞75%。以上兩項積分相加為分級標準：0 分為（-），2～3 分為（±），4～5 分為（+），6～7 分為（++），其中（+）和（++）判定為陽性。

1.4 統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計數資料用χ2檢驗及Spearman等級相關檢驗作統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTGF、VEGF和HIF-1α在胰腺癌和癌旁正常組織中的表達

CTGF、VEGF和HIF-1α在正常胰腺組織中均為0（0/10）表達，而在癌組織中均高表達，陽性率分別為45.7%（21/46）、71.7%（33/46）、76.1%(35/46)，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 CTGF、VEGF和HIF-1α表達與胰腺癌生物學行為的關系

CTGF在胰腺癌組織中的表達水平與性別、腫瘤部位無關，而與年齡、臨床分期、病理分級、淋巴結轉移情況等有關（P＜0.05），年齡越大、分化程度越低，臨床分期越晚，陽性表達率越高。VEGF和HIF-1α在胰腺癌組織中的表達只與臨床分期有關（P＜0.05），與其他腫瘤生物學行為無關。見表1。

2.3 CTGF、VEGF和HIF-1α在胰腺癌中表達的相關性

經相關性檢測，CTGF 與 VEGF、HIF-1α；VEGF 與 HIF-1α 之間的 Spearman 相關系數分別為：r=0.575、r=0.483、r=0.082，即三者兩兩間均存在正相關關系（均P＜0.01）。

3 討論

腫瘤微環境對胰腺癌的形成和發展發揮了重要作用，腫瘤在快速生長的過程中，消耗大量的氧，形成缺氧的局部微環境。體外實驗顯示，小鼠胰腺原位移植瘤VEGF表達明顯增加，而異位移植瘤的VEGF表達不明顯，說明胰腺原位微環境可促進癌細胞VEGF表達，增進血管生成[3]。VEGF是血管生成的主要調節者，能促進內皮細胞生長，并具有血管通透性作用[4]，增加腫瘤局部環境的血流量，促進腫瘤侵襲和轉移。

表1 CTGF、VEGF和HIF-1α表達與胰腺癌生物學行為的關系[n(%)]Tab.1 Relationship between expressions of CTGF,VEGF,HIF-1α and tumor biological behaviour[n(%)]

HIF-1α是HIF-1的調節及活性亞基，在缺氧環境下作為機體細胞特異性應答的中介產物，誘導多種因子生成對抗缺氧，VEGF是其最重要的靶基因，HIF-1α上調VEGF表達并增強其穩定性，對胰腺癌的生長、浸潤起重要作用。Biichler等[5]發現胰腺癌中HIF-1α mRNA表達上調，且與VEGF mRNA表達呈正相關，說明HIF-1α通過上調VEGF表達來促進血管生成，促進胰腺癌生長。

CTGF在結締組織豐富的胰腺癌組織發生發展過程中起到重要作用[6]，但具體作用還不明確。蘇燕等的研究表明CTGF在體外對胰腺癌細胞的生長有抑制作用[7]。但是Bennewith等[8]研究發現內源性的CTGF在體內環境下高表達，并且對胰腺癌的生長發展起重要作用；抑制內源性CTGF表達，胰腺癌細胞的生長在體外及皮下均受到明顯抑制，而CTGF在胰腺癌組織中的作用主要是對抗缺氧；在體外試管缺氧條件下，同樣可以檢測到CTGF的高表達。缺氧能誘導CTGF表達，CTGF和VEGF在血管的生成重構中起重要作用[9]。CTGF在不同環境下對胰腺癌細胞的不同作用，很可能跟缺氧微環境的條件有關。

本研究通過檢測CTGF、VEGF和HIF-1α，三者在46例胰腺癌組織中均存在異常高表達。CTGF的表達隨著惡性程度的增高而增加，并與淋巴結的轉移及年齡有關，提示CTGF的表達增高與胰腺癌的發生、發展，腫瘤惡性程度，淋巴結轉移有關。VEGF和HIF-1α在46例癌中分別有33、35例表達，顯著高于癌旁組織（P＜0.01）。腫瘤的臨床分期越晚，VEGF和HIF-1α的表達越高，提示兩者與胰腺癌的發生、發展有密切關系。CTGF、VEGF和HIF-1α三者在胰腺癌中的表達，兩兩之間均呈正相關，提示三者在胰腺癌的缺氧微環境中共同對抗缺氧，促進腫瘤的生長和發展起重要作用。CTGF在胰腺癌組織的病理分型及淋巴結轉移上可作為一個較好的臨床檢驗指標。聯合檢測CTGF、VEGF和HIF-1α的表達可作為預測胰腺癌預后的一個客觀指標，對胰腺癌的預后判斷有重要意義。

[1]Ioannides CG,Whiteside TL.T cell recognition of human tumors：implications for molecular immunotherapy of cancer[J].Clin Immunol Immunopathol,1993,66(2)：91-106.

[2]胡驍.TGF-β1、HIF-1α、VEGF在胰腺癌中的表達及臨床意義[D].青島大學碩士論文,2009.

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[5]Büchler P,Reber HA,Büchler M,et al.Hypoxia-inducible factor 1 regulates vascular endothelial growth factor expression in human pancreatic cancer[J].Pancreas,2003,26(1)：56-64.

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[7]蘇燕,李宏偉,崔培林,等.轉化生長因子-β1通過促進結締組織生長因子表達抑制胰腺癌細胞PANC-1增殖[J].現代醫學生物進展,2007,7(12)：1761-1764.

[8]Bennewith KL,Huang X,Ham CM,et al.The role of tumor cell-derived connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)in pancreatic tumor growth[J].Cancer Res,2009,69(3)：775-784.

[9]吳賢敏,唐瓊蘭,謝賢鏞,等.CTGF與腫瘤的研究進展[J].川北醫學院學報,2007,22(6)：609-612.