刺玫果藥材中黃酮類成分測定

王光函， 姜 鴻， 張振秋， 尤獻民， 鄒桂欣*

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院遼寧沈陽110034;2.遼寧中醫(yī)藥大學遼寧大連116600)

中藥質量控制和評價是中藥現代化的瓶頸，中藥多成分的復雜性決定了單一成分或指標評價難以表達中藥的質量，并由此提出多成分質量控制的模式［1-2］，本試驗采用Agilent 1100高效液相色譜儀對刺玫果藥材中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素［3］4種成分同時進行測定，更有效的控制刺玫果藥材質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent1100，DAD檢測器，美國)XS105電子天平(梅特勒-托利多中國地區(qū))。

1.2 試藥 蘆丁對照品(批號:10080-200306)、金絲桃苷對照品(批號:1521-200202)、槲皮素對照品(批號:10081-200406)、山柰素對照品(批號:110861-200304)均購自中國藥品生物制品檢定所。刺玫果的干果購于亳州藥材市場。甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純，其余所用試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent SB C18(4.6 mm×150 mm);流動相:甲醇(D)，乙腈-四氫呋喃(1 ∶19)(C)，0.5%醋酸水(A)［4］，梯度洗脫程序見表1。體積流量:1.0 mL/min;檢測波長:360 nm;柱溫:30℃。結果見圖1和圖2。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 對照品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備 取刺玫果藥材(粉碎后)10 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流至提取液無色(約2 h)，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇繼續(xù)提取至無色(約4 h)，提取液蒸干，殘渣加稀乙醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液［5］。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素分別為 38.06 μg、162.65 μg、53.93 μg、4.994 μg的混合對照品溶液。

2.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液1、2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件分別進樣，測定峰面積，以進樣量與峰面積進行線性回歸，回歸方程、線性范圍以及相關系數分別為:

蘆丁:Y=0.003X+0.000 5 r=0.999 8 線性范圍:0.038 1 ～0.456 7 μg

金絲桃苷:Y=0.011X+0.000 2 r=0.999 9 線性范圍:0.162 6 ～1.951 8 μg

槲皮素:Y=0.005X+0.000 3 r=0.999 9 線性范圍:0.053 7 ～0.647 4 μg

山柰素:Y=0.000 8X+0.000 2 r=0.999 8 線性范圍:0.005 ～0.059 9 μg

2.5 穩(wěn)定性試驗 供試品溶液于配置后0、4、8、12 h時，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀中，測定各峰面積，計算蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素質量分數，其RSD分別為1.56%、0.82%、1.23%和1.02%，表明穩(wěn)定性良好。

2.6 對照品精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5 μL，注入液相色譜儀中，平行5次，測定峰面積。蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素的RSD分別為0.18%、0.22%、0.19%和0.18%，表明精密度良好。

2.7重復性試驗 取樣品10 g，5份，精密稱定，按供試液制備方法處理，測定峰面積，計算樣品中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素的質量分數，其RSD分別為2.09%、2.00%、1.87%和1.81%，表明重現性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取樣品5 g，5份，精密稱定，分別精密加入蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對照品適量，按供試液制備方法處理，分別計算回收率及RSD，結果見表2。

表2 加樣回收率結果

2.9 樣品中黃酮的測定 精密吸取供試品溶液10 μL，每個樣品取3份，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積，以3次測定結果的平均值作為測定值，結果見表3。

表3 樣品測定結果

3 討論

3.1 測定波長的選擇 曾采用Agilent紫外分光光度計對蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對照品溶液分別進行掃描，4者在254 nm和360 nm下均有較大吸收，但是用DAD檢測器對供試品測定時發(fā)現，供試品溶液在254 nm下基線不穩(wěn)，且干擾較多，故選擇360nm作為測定波長［6］。

3.2 之前筆者曾采用等度洗脫系統(tǒng)對刺玫果中蘆丁和金絲桃苷進行定量測定，本試驗在此基礎上采用梯度洗脫系統(tǒng)對黃酮類成分進行測定，為更好的評價刺玫果藥材的質量。

3.3 文獻報道，刺玫果總黃酮能降低腦血管阻力，增加冠脈血流量，提高小鼠耐缺氧能力［7-8］，且我國東北野生資源豐富，本試驗選擇黃酮類成分進行測定，為刺玫果資源的客觀評價提供依據［9-10］。

3.4 中藥化學成分多樣且復雜，在指標選擇方面，應開展質量標示性指標與內在質量性指標相結合的方法研究，即應選擇多指標質量控制的方法。實現對中藥多指標成分的控制，也有助于說明藥物的藥用物質基礎，使中藥新藥研究逐漸明確其所含化學成分并控制其量和穩(wěn)定性。這與現階段新法規(guī)［11-13］對中藥新藥研究的要求是一致的，在中藥質量標準中尤其是新藥質量標準中，應努力向建立多指標定量測定的方向發(fā)展，盡可能實現對多種不同工藝、多種指標成分的定量測定控制，多方面控制產品質量，提高現代中藥制劑的質量控制水平。

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［4］中國藥典［S］.一部.2010:30.

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［11］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關于實施《藥品注冊管理辦法》有關事宜的通知.國食藥監(jiān)注［2007］596號［S］.2007-09-26.

［12］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關于印發(fā)中藥注冊管理補充規(guī)定的通知.國食藥監(jiān)注［2008］3號［S］.2008-01-07.

［13］國家食品藥品監(jiān)督管理局.關于印發(fā)中藥、天然藥物注射劑基本技術要求的通知.國食藥監(jiān)注［2007］743號［S］.2007-12-06.