茯苓皮中總三萜超聲波輔助提取工藝優化

摘要：為探討茯苓[Poria cocos （Schw.） Wolf]皮中總三萜的超聲波輔助提取工藝，考察了液固比、超聲波功率、提取時間、提取溫度和茯苓皮干粉粒度對茯苓皮總三萜提取率的影響，并對部分工藝參數采用正交試驗設計進行優化。結果表明，以50%乙醇為提取溶劑、超聲波功率500 W、液固比15∶1（V/m，mL∶g）、干粉粒度0.150 mm、提取溫度50 ℃、提取時間20 min為最優提取參數組合，驗證試驗的提取率為2.6%，正交試驗的優化結果可信。

關鍵詞：茯苓[Poria cocos （Schw.） Wolf]皮；總三萜；超聲波輔助提取；正交試驗

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3939-04

中藥茯苓是多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos （Schw.） Wolf]的干燥菌核[1]，為中國常用的道地中藥材，是多種復方藥及中成藥（300多種）的重要原料[2]，具有利水消腫、滲濕、健脾及寧心等功效。茯苓的主要生物活性成分為三萜類物質和多糖等[3-5]，三萜類物質具有免疫調節、抗腫瘤和抗炎等作用[6]，并對人體白血病細胞系HL-60有誘導分化作用[7]。茯苓皮中富含三萜類物質，但在茯苓加工過程中大多被作為廢棄物處理，對資源造成了極大浪費。

茯苓總三萜的提取方法主要包括傳統的有機溶劑提取法以及超臨界萃取法。有機溶劑提取法往往提取時間長、效率低、需要消耗大量的有機溶劑、易造成污染；超臨界萃取法提取步驟繁瑣[8]。而超聲波輔助提取法作為一種新型的提取技術，具有簡單、高效、低成本、高提取率等特點[9]。為了擴大茯苓三萜類物質藥源和開發新型功能性深加工食品，研究對采用超聲波輔助提取茯苓皮中總三萜的工藝進行探討，著重考察了超聲波功率、茯苓皮干粉粒度、液固比、提取時間和提取溫度等因素對茯苓皮總三萜提取率的影響，并通過正交試驗設計優化了主要工藝條件，旨在為茯苓資源的深度開發利用提供科學依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 茯苓皮收集自湖北省黃岡市羅田縣九資河鎮，去除雜質后風干，常壓干燥，粉碎過篩備用。

1.1.2 儀器與設備 HF-2B型超聲循環提取機購自北京弘祥隆生物技術股份有限公司，EYELAN-1000型旋轉蒸發儀購自日本東京理化器械株式會社，UV-1700紫外可見分光光度計購自日本島津公司，Cary 100紫外-可見分光光度計購自美國瓦里安技術中國有限公司，AX-205電子天平購自瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 總三萜的提取 取茯苓皮干粉，于60 ℃干燥至恒重，加入體積分數為50%的乙醇，用超聲波輔助提取，以3 000 r/min離心10 min，提取3次，合并各級提取液，于60 ℃真空濃縮揮干乙醇，定容，用石油醚脫脂，用飽和正丁醇萃取，定容、檢測。

1.2.2 總三萜提取率的測定 以熊果酸為標準品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色法進行茯苓皮總三萜濃度的測定[10]。①熊果酸測定波長的確定及標準曲線的制作。準確稱取熊果酸標準品5 mg，用95%乙醇定容至50 mL，配制成0.1 mg/mL的標準液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL標準液，水浴加熱除去溶劑后，加入新配制的0.4 mL 50 g/L香草醛-冰乙酸及1.8 mL高氯酸，于70 ℃恒溫水浴加熱20 min，取出用流水冷卻至室溫，再加入5 mL冰乙酸，搖勻，經分光光度計掃描確定波長，測定吸光度，繪制標準曲線。②茯苓皮中總三萜提取率的測定。測定提取液吸光度，以標準曲線為參比求出提取液的總三萜濃度，再根據總三萜提取率的計算公式計算茯苓皮中總三萜的提取率。茯苓皮中總三萜的提取率=（提取液中總三萜的濃度×稀釋倍數×提取液體積/茯苓皮質量）×100%。

1.2.3 單因素試驗 通過單因素試驗考察超聲波輔助提取時的液固比、超聲波功率、提取溫度、提取時間和干粉粒度等因素對茯苓皮總三萜提取率的影響，以確定各參數范圍，為工藝參數的優化提供依據。①液固比對提取率的影響。以不同粒度（0.124、0.150、0.178、0.250、0.420、0.840和2.000 mm）的茯苓皮混合干粉為材料，以50%乙醇為溶劑，在超聲波功率為500 W、提取溫度為50 ℃、提取時間為20 min的條件下，按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（V/m，mL∶g，下同）來提取茯苓皮總三萜。②超聲波功率對提取率的影響。以不同粒度（0.124、0.150、0.178、0.250、0.420、0.840和2.000 mm）的茯苓皮混合干粉為材料，以50%乙醇為溶劑，在液固比為15∶1、提取溫度為50 ℃、提取時間為20 min的條件下，選擇不同超聲波功率（200、400、600、800和1 000 W）進行茯苓皮總三萜的提取。③提取溫度對提取率的影響。以不同粒度（0.124、0.150、0.178、0.250、0.420、0.840和2.000 mm）的茯苓皮混合干粉為材料，以50%乙醇為溶劑，在液固比為15∶1、超聲波功率為500 W、提取時間為20 min的條件下，選擇不同提取溫度（20、30、40、50、60和70 ℃）進行茯苓皮總三萜的提取。④提取時間對提取率的影響。以不同粒度（0.124、0.150、0.178、0.250、0.420、0.840和2.000 mm）的茯苓皮混合干粉為材料，以50%乙醇為溶劑，在液固比為15∶1、提取溫度為50 ℃、超聲波功率為500 W的條件下，選擇不同提取時間（10、20、30、40、50、60 min）進行茯苓皮總三萜的提取。⑤干粉粒度對提取率的影響。以50%乙醇為溶劑，在超聲波功率為500 W、液固比為15∶1、提取溫度為50 ℃、提取時間為20 min的條件下，選擇不同粒度的（0.124、0.150、0.178、0.250、0.420、0.840和2.000 mm）干粉進行茯苓皮總三萜的提取。

1.2.4 正交試驗 為獲得最優的萃取工藝條件，以50%乙醇為溶劑，超聲波功率為500 W，在單因素試驗基礎上，選取液固比、提取溫度、提取時間以及干粉粒度作為考察因素，以提取率為考察指標進行正交試驗。通過SPSS系統創建L9（34）正交表，試驗的因素與水平見表1。

1.2.5 提取工藝參數的優化 為獲得最優提取工藝條件，綜合單因素試驗結果，以提取率為考察指標，通過SPSS系統創建L9（34）正交表，對液固比、提取溫度、提取時間和干粉粒度等因素進行優化，獲得最優的提取工藝參數。

1.2.6 數據處理方法 采用統計軟件SPSS進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 液固比對提取率的影響 隨著液固比逐漸增大，總三萜的提取率也隨之增大，這是由于溶劑用量的增大使溶液的濃度梯度增大，有利于總三萜的溶出和擴散。但在液固比達到15∶1之后，提取率增大趨勢減緩，表明提取已經充分，為節省溶劑，故選取15∶1作試驗用液固比。

2.2.2 超聲波功率對提取率的影響 隨著超聲波功率的增大，總三萜的溶解度也相應增加。這主要是由于超聲波功率越大，其對處理樣品的空化率、機械效應以及熱效應均隨之增大，有效促進了總三萜的溶出。但提取率與超聲波功率增大并不成正比，當超聲波功率提高到一定程度時，提取率增加幅度逐漸減小，同時，超聲波功率過高會加速儀器的老化且不利于節能環保，在選定的試驗條件下以500～600 W為宜，后續試驗選用500 W作為超聲波功率。

2.2.3 提取溫度對提取率的影響 提取率隨提取溫度的升高而增加，在55～60 ℃時達到最高點，隨后提取率隨提取溫度升高而逐漸降低。這是因為隨著提取溫度的升高，被提取有效成分的蒸氣壓增大，其擴散系數和傳質系數都增大，提取液的濃度雖然增高，但總三萜具有易揮發的特點，當提取溫度升高到一定程度時，因提取劑及總三萜的揮發，從而使總的提取率下降。綜合考慮到提取溫度過高會增加能耗，且易出現安全隱患，將提取溫度選定為50 ℃。

2.2.4 提取時間對提取率的影響 在前30 min內，總三萜提取率隨著提取時間的延長而增加，40 min后提取率維持緩慢增加，但增加幅度較小。這是因為在超聲波輔助提取過程剛開始時，由于溶劑與溶質未充分接觸，提取率較低；隨著提取時間的延長，溶劑與溶質接觸充分，有效成分提取率提高，且隨著提取時間加長，傳質達到某種程度，則提取速率增大，達到最大值后，由于待分離組分的減少，傳質動力降低而提取速率降低，提取率增加就緩慢。從經濟上考慮，超聲波輔助提取的最佳提取時間選定為20 min。

2.2.5 干粉粒度對提取率的影響 干粉粒度對茯苓皮總三萜提取率的影響十分顯著，總三萜提取率隨著粒度的減小而增大，這是因為待處理樣品的粒度越小，固體與提取溶劑間的接觸面積越大，傳質表面積亦增加，有利于物質的溶出。當粒度達到0.178 mm時，提取率達到最大值，隨后又出現下降，這是由于粒度過小、過細，茯苓干粉細胞已遭到破壞，超聲波的空化效應對其作用不明顯，且由于粒度過小，吸附作用相應增加，故繼0.178 mm處出現峰值過后，提取率又有所下降。綜合考慮干粉粒度取0.178 mm較為合適。

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。由表2的直觀分析可知，超聲波輔助提取茯苓皮中總三萜的最佳工藝條件為A2B3C1D2，極差為B>C>A>D，即干粉粒度對提取率的影響最大，其次為提取溫度和液固比，提取時間對提取率的影響最小。

通過SPSS方差分析可知，4個因素不同水平對超聲波輔助提取均具有極顯著影響（P<0.01）。由表2和方差分析結果可知，以50%乙醇為溶劑，在超聲波功率為500 W的條件下，提取茯苓皮總三萜的最佳工藝條件為液固比15∶1、提取溫度50 ℃、提取時間20 min、干粉粒度0.150 mm，在這個條件下，總三萜提取率為2.579%。

2.4 驗證試驗結果

為進一步考察優選工藝的可靠性及穩定性，按上述最優提取條件（超聲波功率500 W、液固比15∶1、提取溫度50 ℃、提取時間20 min、干粉粒度0.150 mm）進行驗證試驗，3次重復試驗，總三萜提取率為2.6%。結果表明，在優化后的工藝條件下進行超聲波輔助提取具有較好的重復性，獲得的總三萜提取率較高，說明正交試驗結果是可信的。

3 結論與討論

在超聲波輔助提取茯苓皮總三萜單因素試驗所得結果基礎上進行了正交試驗，正交試驗所得最佳工藝條件為超聲波功率500 W、液固比15∶1、干粉粒度0.150 mm、提取溫度50 ℃、提取時間20 min，此條件下茯苓皮中總三萜提取率的驗證試驗結果為2.6%，充分說明該條件的穩定可靠。

沈思[11]采用有機溶劑甲醇，在提取時間6 h、溫度70 ℃、料液比1∶20、提取2次條件下提取茯苓皮總三萜，此條件下茯苓皮總三萜提取率最高，為1.39%；桂元等[12]采用超臨界CO2萃取法，在夾帶劑用量2.0 mL/g、萃取壓強35 MPa、萃取溫度65 ℃、萃取時間60 min條件下，茯苓皮中總三萜提取率為2.06%。采用超聲波輔助提取方法所得最高提取率高出傳統有機溶劑醇提法87.1%、高出超臨界CO2萃取法26.2%。由此可見，采用超聲波輔助提取得到的提取率遠高于采用有機溶劑甲醇和超臨界CO2萃取法得到的。

超聲波輔助提取法作為天然產物活性成分分離提取的一種新的方法，與傳統的煎煮法、回流法、溶劑浸提法相比，超聲波輔助提取法具有多方面的優點，如提取溫度低，從而可以更加有效地保護天然活性成分不受破壞；實用性較廣，可用于很多天然產物的提取；提取時間短，可大大降低能耗和成本。此外，超聲波輔助提取還具有方便、可操作性強和一定的殺菌作用，可有效保護提取液不變質，有較高的實用價值，值得認真探索與研究。

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