精索靜脈曲張對青春期大鼠性激素以及其睪丸受體的影響

李超鵬 ，張 端 ，史婷婷 ，張雁鋼 ?

1.山西醫科大學第一醫院泌尿外科，山西太原 030001；2.山西醫科大學第一醫院藥理學教研室，山西太原 030001

精索靜脈曲張（varicocele，VC）是青壯年男性常見的疾病，是因精索靜脈血流淤積而造成精索蔓狀叢（靜脈血管叢）血管擴張、迂曲變長。發病率男性人群為10%～15%，以左側發病為多。Trussell等[1]研究發現，77.5%的不育患者有不同程度的雙側精索靜脈曲張，15.5%的患者伴有單側精索靜脈曲張。VC可伴有睪丸萎縮、精子生成障礙和精液異常。有明確的證據表明VC對睪丸的損害隨時間進展而累積，并最終導致不育的發生[2]。Boucher等[3]研究發現伴有精索靜脈曲張的不育患者精子發生和間質細胞功能障礙并伴有垂體功能亢進。對于VC引起不育的機制的研究主要集中在陰囊高溫、代謝產物反流、下丘腦-垂體軸功能不足、睪丸局部缺氧、DNA損傷等方面[4]。本研究通過建立青春期大鼠實驗性左側精索靜脈曲張（experimental left varicocele，EV）模型，探討 VC對大鼠性激素及其受體的影響，揭示性激素及性腺軸功能障礙對大鼠生精功能的可能影響，為VC導致不育的機制研究提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

大鼠的青春期通常為（50±10）d，選擇鼠齡6周、體重110～130 g的Wistar雄性大鼠作為青春期大鼠，由山西醫科大學生理教研室動物房提供。

1.2 動物模型的建立及實驗分組

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，部分結扎左腎靜脈。具體方法如下：取腹部正中切口，游離左腎靜脈，在左腎上腺靜脈和睪丸靜脈內側、腎靜脈匯入下腔靜脈處，置一根直徑為0.55 mm的金屬桿，與左腎靜脈一起結扎，借此使左腎靜脈直徑縮小約1/2。結扎后將金屬桿拔出，可見部分結扎的左腎靜脈迅速擴張。3-0絲線縫合切口。對照組游離左腎靜脈，但不結扎。

實驗分組：共對18只大鼠進行左腎靜脈結扎手術，隨機分為三組，每組各6只，術后2、4、8周均檢測血清性激素及取睪丸組織。對照組18只，隨機分為三組，與相應手術組做相同處理。以精索靜脈最大徑大于1 mm、左腎無缺血萎縮為造模成功標準。

1.3 標本采集

分別于術后2、4、8周取大鼠睪丸組織，一部分研磨，制成組織勻漿（w/v=1∶9），剩余部分用 Bouin′s 液固定 24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，蠟塊包埋。于晨9時至11時下腔靜脈取靜脈血，離心后取血清，-40℃保存備用。

1.4 標本處理方法

1.4.1 HE染色 切片，厚度為4 μm，脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色、脫水、封片。光鏡下觀察各組大鼠睪丸組織及生精上皮變化。

1.4.2 放射免疫方法 應用放射免疫法測定睪丸組織睪酮濃度（intratesticular testosterone concentration，ITC）及血清卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）含量，試劑盒由北京北方生物技術研究所提供，具體操作步驟均按試劑盒說明書進行。

1.4.3 免疫組化方法 切片厚度為4 μm，采用SP法進行免疫組化染色，切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育15 min以消除內源性過氧化物酶，正常山羊血清37℃封閉15 min，抗原修復，兔抗大鼠 AR、FSHR、LHR 抗體（1∶100）4℃過夜，恢復至室溫，滴加生物素標記山羊抗兔IgG，37℃孵育15 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃孵育15 min，以上各步驟間用pH 7.4的PBS緩沖液洗3次，每次3 min；DAB顯色3～10 min，自來水終止顯色；蘇木素復染1 min，鹽酸酒精浸泡5 s，氨水5 s，常規脫水，透明，封片。用PBS液代替一抗作陰性對照，其余步驟同前。結果用圖像分析軟件BI-2000醫學圖像分析系統對實驗組和對照組大鼠睪丸AR、FSHR和LHR免疫組化灰度值進行測量和分析，每張切片（400×）隨機選取5個視野，測量陽性細胞平均灰度值，平均灰度值越低表示免疫反應陽性越強。

1.4.4 細胞凋亡檢測方法 切取4 μm厚睪丸組織石蠟切片，脫蠟、脫水、透明，其余步驟按試劑盒說明書進行TUNEL（試劑盒由北京中山金橋公司提供）染色法行細胞凋亡檢測（加POD前在熒光顯微鏡下分析結果并拍照），細胞核染成棕色者為TUNEL陽性細胞，光鏡下（400×）每張切片選取5個視野，計數500個細胞，計算凋亡細胞所占生精細胞的百分率作為生精細胞的凋亡指數（AI）。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 HE染色結果

對照組睪丸組織中生精上皮基膜完整，各期生精細胞排列有序，層次清楚，管腔里有大量精子。2周實驗組較對照組無明顯變化。4周實驗組睪丸生精上皮基膜變薄，各級生精細胞減少，結構稀疏，管腔中精子數量減少，小管間隙變寬，間質細胞減少。8周實驗組生精上皮基膜破裂溶解，各級生精細胞排列紊亂、數量減少，細胞間隙增大，細胞體積縮小，管腔中可見脫落的不成熟生精細胞，成熟精子細胞減少，間質水腫，間質細胞進一步減少。

2.2 放射免疫結果

見表1。

2.3 免疫組化結果

特異性AR免疫染色可見AR主要表達于間質細胞的細胞質及細胞核，其他可見于支持細胞、肌樣細胞、精原細胞、血管平滑肌細胞及內皮細胞；FSHR主要表達于支持細胞的細胞質；LHR主要表達于間質細胞的細胞膜，間質細胞細胞質也有少量表達。其結果見表2。

2.4 細胞凋亡檢測結果

2周實驗組凋亡細胞主要為間質細胞，可見少量初級精母細胞凋亡；4周實驗組可見間質細胞凋亡，曲細精小管中除精原細胞外，其他各級細胞都出現凋亡；8周實驗組可見間質細胞明顯減少，曲細精小管中除精原細胞外，其他各級細胞都出現凋亡，管腔變薄，細胞層次紊亂，管腔中可見大量凋亡的分裂晚期的精子細胞。對照組中可見少量凋亡細胞，主要集中在次級精母細胞及分裂期的精子細胞。兩組凋亡結果見表3。

3 討論

精索靜脈曲張是青壯年男性常見病，是男性不育的重要因素，但精索靜脈曲張與男性不育的確切關系目前尚無定論。研究發現，精索靜脈曲張可致患者性激素分泌紊亂并可致下丘腦-垂體-性腺軸功能障礙，而性激素對生精功能有重要調控作用。睪酮主要由睪丸間質細胞分泌，受下丘腦-垂體-性腺軸的調節控制。睪酮的主要功能之一就是維持生精作用，如果睪酮分泌減少，精子發生過程將停滯在初級精母細胞階段；FSH和LH均由腺垂體分泌，對生精過程均有調控作用。FSH對生精過程有啟動作用，而睪酮對生精過程有維持效應；LH對生精過程的調節作用不是直接影響生精細胞，而是通過刺激睪丸間質細胞分泌睪酮而間接發生作用[5]。Li-Ming等[6]研究精索靜脈曲張伴不育的患者時，發現行精索靜脈曲張切除術后可顯著提高患者的血清睪酮濃度，雖然升高患者的血清T濃度并不一定能夠直接改善患者精液質量，但是可以改善患者激素分泌和生精功能。Cayan等[7]發現行精索靜脈曲張切除術后可改善支持細胞和間質細胞功能，顯著降低患者的FSH和提高患者的血清T濃度，并可提高精子濃度和活力。T、FSH和LH都是通過與其相應的受體結合后發揮調節作用，本實驗試圖通過精索靜脈曲張對性激素、激素受體及性腺軸的影響來解釋大鼠生精功能降低的發生過程和機制。

表1 各組大鼠左側睪丸ITC和血清性激素濃度（ ±s）Tab.1 ITC and serum sex hormone concentrations of the left testis in rats of all groups( ±s)

表1 各組大鼠左側睪丸ITC和血清性激素濃度（ ±s）Tab.1 ITC and serum sex hormone concentrations of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：相同時間段內實驗組與對照組相比有差異（P＜0.05）；實驗組或對照組內不同時間段比較，▲與2周組比較有差異（P＜0.05）；★與4周組比較有差異（P＜0.05）Note：◆ there was significant differences between experiment group and control group （P＜0.05）;▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分組 只數 睪丸組織中睪酮濃度（nmol/L）血清睪酮濃度（nmol/L）卵泡刺激素濃度（ng/ml）黃體生成素濃度（ng/ml）對照組2周組4周組8周組實驗組2周組4周組8周組666 666 9.32±1.71 9.51±1.50 9.48±1.45 1.07±0.28 1.12±0.26 1.14±0.19 1.06±0.32 1.35±0.58 1.30±0.56 2.98±1.0 2.89±0.5 3.20±0.6 9.01±0.98 7.11±1.74◆▲4.46±1.24◆▲★1.01±0.26 0.93±0.17 0.38±0.11◆▲★1.23±0.48 1.57±0.54 1.96±0.60◆▲3.02±0.5 3.24±0.8 5.35±1.37◆▲9 7363★

表2 各組大鼠左側睪丸組織AR、FSHR、LHR平均灰度值（ ±s）Tab.2 The average gray value of AR,FSHR,LHR of the left testis in rats of all groups( ±s)

表2 各組大鼠左側睪丸組織AR、FSHR、LHR平均灰度值（ ±s）Tab.2 The average gray value of AR,FSHR,LHR of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：◆相同時間段內實驗組與對照組相比有差異（P＜0.05）；實驗組或對照組內不同時間段比較，▲與2周組比較有差異（P＜0.05）；★與4周組比較有差異（P＜0.05）Note：◆ there were significant differences between experiment group and control group (P＜0.05);▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分組 只數 雄激素受體 卵泡刺激素受體 黃體生成素受體對照組2周組4周組8周組實驗組2周組4周組8周組666 666 144.29±7.85 144.41±5.46 141.78±6.85 128.57±8.00 120.49±4.04 126.89±8.28 156.89±8.22 155.64±11.80 155.45±10.34 136.61±3.65 154.98±8.58▲160.07±5.29◆▲122.47±4.34 125.02±6.54 141.28±5.73◆▲★138.77±7.41◆★158.45±6.46 171.31±8.29◆▲★

表3 各組大鼠左側睪丸組織凋亡率（ ±s）Tab.3 The apoptosis rate of the left testis in rats of all groups( ±s)

表3 各組大鼠左側睪丸組織凋亡率（ ±s）Tab.3 The apoptosis rate of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：◆相同時間段內實驗組與假手術組相比有差異（P＜0.05）；實驗組或對照組內不同時間段比較，▲與2周組比較有差異（P＜0.05）；★與4周組比較有差異（P＜0.05）Note：◆ there were significant differences between experiment group and control group (P＜0.05)； ▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分組 只數 凋亡率（%）對照組2周組4周組8周組實驗組2周組4周組8周組666 666 5.97±0.90 5.35±1.05 6.28±0.89 8.74±1.79◆★19.08±2.31◆▲30.61±1.77◆▲★

本實驗發現，實驗組大鼠造模成功后2周時睪丸間質細胞凋亡顯著增加，隨時間進展而進一步增加；實驗組大鼠生精細胞于造模成功4周時凋亡顯著增加，8周時凋亡進一步加重。造模成功4周時實驗組ITC開始下降，且隨時間進展而進一步下降，這個結果與劉建軍等[8]的實驗結果一致。4周時血清T濃度與對照組并無明顯差異，可能是由于除睪丸組織外，腎上腺等分泌的T代償性增加，維持血清T在正常濃度。血清T濃度于8周時開始下降，這與AndóS等[9]的研究結果一致，但Canales等[10]研究卻發現VC并不明顯降低患者外周血T濃度，這可能與外周血血清T濃度遠遠低于ITC，而不同程度的靜脈曲張對間質細胞影響不同所致，本實驗中實驗組大鼠外周血T下降可能與ITC較4周時進一步下降而睪丸組織外睪酮分泌不足以代償有關。血清FSH、LH濃度于造模成功8周后顯著上升，這可能是由于血清T濃度下降使其對垂體抑制作用降低導致的。AR于造模4周后表達下降，這與ITC的下降是同步的，內源性T可控制睪丸內AR的表達，這可能與雄激素能降低AR的降解速率以及控制AR蛋白的生物合成有關[11]。FSHR在造模8周時表達顯著降低，可能是由于血清FSH濃度升高，抑制了FSHR的表達。LHR在造模2周時表達顯著升高，這可能是間質細胞凋亡減少后通過某種代償機制使LHR表達升高，維持LH對間質細胞分泌睪酮的促進作用，使睪酮保持較高濃度，從而維持睪丸的生精作用；到4周時則與對照組比較無差異，LH對ITC分泌的刺激作用較2周時下降，這可能是由于睪丸間質細胞功能障礙致使LHR表達降低；到造模后8周時，LHR較對照組表達顯著降低，可能是由于較高的血清LH以及間質細胞功能障礙等因素抑制了LHR的表達。

由于T和FSH都是通過各自的受體發揮生理功能，因此，AR和FSHR的變化反映了這兩種激素在精子發生過程中的有序表達和整體功能，它們在T和FSH的作用下，共同調節精子發生過程中的程序性基因表達[12]。缺少其中的任何一種激素都會導致精子發生的障礙：缺乏T，則不能完成精子細胞的變態，而缺乏FSH，則會導致粗線期精母細胞的程序性死亡[13]。實驗發現精索靜脈曲張可致大鼠ITC、血清T下降，并使AR表達下降，而睪丸的生精過程需要睪丸組織高濃度的ITC。在精索靜脈曲張進展初期，間質細胞就已經開始受損，且早于生精細胞，間質細胞可能通過上調LHR水平，來代償性增加睪酮分泌，使睪酮維持在正常水平，隨著間質細胞凋亡增加，ITC逐漸失代償，而睪丸生精細胞凋亡增加與ITC下降同步，這與生精細胞成熟需要睪丸內較高濃度睪酮的結論是相符合的。垂體分泌FSH、LH受血清T濃度的影響，二者受體表達與其血清水平呈反比，在VC進展后期雖然二者血清濃度上升，可由于睪丸間質細胞過度凋亡，ITC顯著下降，即使FSH及LH維持正常甚至較高的功能，生精過程也無法正常完成。

隨著VC的進展，EV大鼠睪丸間質細胞及生精細胞的損傷和凋亡會逐漸增加，導致ITC及血清T濃度下降，并使睪丸AR表達降低；FSH、LH濃度會隨著血清T下降而上升，二者睪丸受體表達隨之出現降低?？傊?，VC通過影響ITC和血清T、FSH、LH濃度及其睪丸受體的表達，進而影響生精細胞發生、增殖和分化等一系列的生理過程，甚至引起不育。

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