9種殺菌劑對蕓薹生鏈格孢菌毒力的測定

2011-01-31 11:01:44楊冠美鄭永利吳華新吳降星章初龍林福呈

浙江農業(yè)科學 2011年3期

楊冠美，鄭永利，吳華新，吳降星，章初龍，林福呈

(1.浙江大學生物技術研究所，浙江杭州 310029;2.浙江省植物保護檢疫局，浙江杭州 310020;3.慈溪市農業(yè)監(jiān)測中心，浙江慈溪 315300;4.寧波市農業(yè)環(huán)境與農產品質量監(jiān)督管理總站，浙江寧波 315012)

9種殺菌劑對蕓薹生鏈格孢菌毒力的測定

楊冠美1，鄭永利2，吳華新3，吳降星4，章初龍1，林福呈1

對從西蘭花花球上分離的1株菌株進行電鏡的初步觀察，經過形態(tài)學和分子生物學的鑒定認為該菌株為蕓薹生鏈格孢 (Alternaria brassicicola);采用菌絲生長速率法研究了9種殺菌劑對蕓薹生鏈格孢菌絲生長的抑制作用，通過毒力方程計算出EC50依次為凱澤 (0.326 35 μg·mL－1) ＜氟菌唑 (0.548 36 μg·mL－1) ＜翠澤 (0.577 29 μg·mL－1) ＜好力克 (1.183 43 μg·mL－1) ＜凱潤 (4.639 82 μg·mL－1) ＜世高 (8.627 8 μg·mL－1) ＜百泰 (18.372 88 μg·mL－1) ＜達科寧 (794.480 6 μg·mL－1) ＜翠貝 (872.017 4 μg·mL－1)，其中凱澤毒力最強，氟菌唑和翠澤對蕓薹生鏈格孢也有較強的抑制作用。

蕓薹生鏈格孢;殺菌劑;毒力測定;EC50

由于鏈格孢 (特別是小孢子種)來自寄主和來自培養(yǎng)基上的分生孢子，形態(tài)具有較大差異，特別易受培養(yǎng)條件的影響，而且產孢表型存在一些中間類型，種間差異并不顯著，用常規(guī)的方法很難進行種級分類鑒定，因此分子生物學的方法(RAPD、RFLP、AFLP、序列分析等)越來越多的應用到鏈格孢的系統研究中［1－3］。

鏈格孢屬中蕓薹鏈格孢 (Alternaria brassicae)，蕓薹生鏈格孢 (Alternariabrassicicola)和蘿卜鏈格孢 (Alternaria japonica)是引起十字花科蔬菜黑斑病的常見種類，通過蕓薹屬和蘿卜屬蔬菜的種子及雜草和植株病殘體等途徑傳播危害十字花科蔬菜［4］。西蘭花為十字花科蕓苔屬甘藍種的變種，是富含營養(yǎng)，人們喜食的蔬菜之一，被譽為“蔬菜皇冠”［5］，本文從浙江省慈溪市天元鎮(zhèn)西蘭花花球上分離到一株鏈格孢屬菌株，應用分子生物學(ITS)的鑒定方法，確定該菌株為蕓薹生鏈格孢，并進行了室內藥效測定，以期為該菌株可能導致西蘭花病害的防治研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與保存

將采集的浙江省慈溪市天元鎮(zhèn)西蘭花花球標本，進行菌株的分離，具體分離方法參照文獻進行［6］，分離時取約 5 mm×3 mm組織塊，先在70%乙醇中浸泡10 s，再置于0.5%次氯酸鈉中浸泡1 min，無菌水漂洗3次后，種植在 PDA平板上，然后放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待分離組織長出菌絲后，取菌落邊緣菌絲再轉置PDA上培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)分離物，將純菌種培養(yǎng)7 d后密封保存在石蠟中以備用。

1.2 菌株形態(tài)鑒定

對菌株的形態(tài)進行觀察，包括菌絲、分生孢子、分生孢子梗及喙的形態(tài)，結合相關資料進行種的鑒定［7］，在光學顯微鏡下拍照，記錄菌株重要形態(tài)特征。

1.3 ITS序列擴增

待菌株長滿培養(yǎng)皿后，刮取菌絲，用基因組小量提取試劑盒提取基因組DNA，總DNA直接用于PCR擴增，根據肖長坤等［8］對引起十字花科黑斑病的3個鏈格孢屬真菌中蕓薹生鏈格孢的特異性引物對分離的菌株進行 PCR擴增，特異性引物為:引物Abral(5'-ACCTCAGCAGCATCTGCTGTTG-3')和Abra2(5'-GGCTTTATGGATGCTGACCTTG-3')，PCR 反應體系 (50 μL):10 × PCR Buffer 5 μL，dNTPs 0.4 μL，DNA 模板 2 μL，引物 0.5 μL，Taq 酶 1 μL，ddH2O 40.6 μL。

PCR反應循環(huán)參數為:預變性94℃，5 min;變性94℃，40 s;退火62℃，40 s;延伸72℃，60 s;35個反應循環(huán);最后延伸72℃，10 min。PCR產物在1.0% 的瓊脂糖上凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像儀下拍照。用PCR產物純化試劑盒 (axygen incorporation，China) 膠回收純化后，以與PCR擴增相同的引物用ABI 3730測序儀(applied biosystems，USA)測序。

1.4 藥劑室內篩選與毒力測定

1.4.1 供試藥劑

9供試藥劑種類及有效成分見表1。

1.4.2 毒力測定

采用平皿菌絲生長速率法測定供試藥劑對菌絲生長的抑制活性，即在預試驗的基礎上，配置各藥劑對菌株菌絲生長抑制率在10%～90%范圍內的幾個不同濃度［9］(表2)。然后將不同濃度的藥劑與PDA混合，倒入6 cm的培養(yǎng)皿中制成系列濃度的含藥平板，實驗用等量無菌水做空白對照，每個處理3次重復。

表1 供試藥劑名稱及有效成分

將在PDA上培養(yǎng)7 d的菌株，用5 cm無菌打孔器打取菌餅，菌絲面朝下接種到含藥培養(yǎng)基平板中央，倒置放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d后，用十字交叉法測量各個培養(yǎng)皿內菌落直徑，并求出3次重復的平均值。

采用生長速率抑制法，計算相對抑菌率［10］。計算公式如下:抑菌率 (%) = (對照菌落直徑－處理菌落直徑) ÷對照菌落直徑×100%。應用DPS軟件進行統計分析，求出各藥劑的毒力回歸方程及相關系數r和有效中濃度EC50。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 形態(tài)學特征

顯微鏡觀察結果為:散落很多分生孢子，有橫隔和縱隔，長鏈狀。分離的菌株在PDA上培養(yǎng)形狀為:菌落初期為灰白色，短絨狀，邊緣整齊，菌落圓形，后期逐漸轉為褐色至灰黑色;分生孢子深褐色，廣卵圓，卵形，近橢圓形或倒棍棒形，縱隔膜相對較少，0～4個，橫隔處縊縮明顯，3～7個橫膈，無喙或形成短的假喙 (圖1)，初步鑒定該菌為蕓薹生鏈格孢［7，11－12］。

2.1.2 ITS的PCR擴增序列分析

對分離的菌株用蕓薹生鏈格孢的特異性引物擴增出了400～500 bp左右的目標條帶 (圖2)，將測得的序列提交 GenBank進行 BLAST比對，GenBank登錄號為 HM138205。結果表明，所測序列與蕓薹生鏈格孢標準菌株 CBS125088(GQ496082)同源性達99%。因此形態(tài)學和分子生物學方法都證明該菌為蕓薹生鏈格孢。

表2 9種殺菌劑對蕓薹生鏈格孢的毒力

圖1 菌株的分生孢子 (左)和菌絲 (右)

2.2 毒力測定分析

9種藥劑對蕓薹生鏈格孢的毒力測定結果見表2。

測定結果表明，9種藥劑對蕓薹生鏈格孢菌絲生長抑制作用有明顯的差異，凱澤對所分離的蕓薹生鏈格孢菌的毒力最高，抑制濃度在3.125 μg·mL－1時，抑制率達 97.6%，EC50僅為0.326 35 μg·mL－1，其次為氟菌唑、翠澤、好力克，它們的EC50均極顯著低于其他4種供試藥劑，其中翠貝、達科寧抑制效果最差。

圖2 PCR擴增結果

3 小結和討論

本試驗對采自浙江省慈溪市天元鎮(zhèn)的西蘭花花球分離的菌株進行了分離純化和顯微鏡形態(tài)特征的觀察，根據分生孢子的形態(tài)如有無橫隔和縱隔、喙的形態(tài)，產孢梗的延伸方式，初步鑒定為蕓薹生鏈格孢［7，11－12］，根據肖長坤等人對引起十字花科黑斑病的的3個鏈格孢屬真菌中蕓薹生鏈格孢的特異性引物對分離的致病菌進行PCR擴增［4］，ITS序列(GenBank登錄號為 HM138205)BLAST比對結果與蕓薹生鏈格孢CBS 125088(GQ496082)同源性達99%，進一步證明該菌為蕓薹生鏈格孢。李明遠曾報道引起南方十字花科蔬菜黑斑病的主要病原菌為蕓薹鏈格孢，而引起北方十字花科蔬菜病原菌除了蕓薹鏈格孢外還有蕓薹生鏈格孢［13］，本實驗采集的西蘭花在冬季12月份，雨水較多低溫條件可能為蕓薹生鏈格孢在南方引起黑斑病發(fā)生提供了條件，對于蕓薹生鏈格孢的生長習性以后將做進一步的研究。本實驗對9種殺菌藥劑進行了毒力測定，含有效成分為50%煙酰胺的藥劑凱澤對蕓薹生鏈格孢菌的毒力最強，可作為防治該菌株引起病害病的首選藥劑，其次氟菌唑、翠澤、好力克對其也有較好的藥效，對這4種藥劑在田間的防治效果將做進一步的研究。

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