蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致小鼠肝損傷的保護作用

1 材料與方法

1.1 藥品

蠶蛹蟲草多糖。將活化的青海蟲草液體菌種(浙江省農業科學院提供)接種于固體培養基(蠶蛹∶玉米面 ∶營養液為 4∶1∶9，營養液:蔗糖 20 g·L－1+蛋白胨 3 g·L－1+ 瓊脂 15 g·L－1+ 復合維生素 0.04 g·L－1+MgSO41 g·L－1+KH2PO41 g·L－1)上，按菌液∶培養基 =1∶5比例接種，置于25℃恒溫培養箱中培養7 d后，采集培養基表面菌絲體，烘干粉碎，加定量蒸餾水90℃水浴提取4 h，過濾得上清液，加3倍的95%乙醇4℃靜置過夜，12 000 r·min－1離心10 min，取沉淀用蒸餾水溶解凍干，得蠶蛹蟲草多糖。氫化可的松注射液購自山西晉新雙鶴藥業有限公司。

1.2 實驗動物及環境

ICR小鼠，雄性，體重 (30±2)g，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供 (動物飼養合格證號:SCXK浙2008－0033)。環境清潔級，溫度(25±2)℃，相對濕度50% ～70%，自然光照，自由取食與飲水，預試期7 d。

1.3 主要試劑與儀器

主要試劑有超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽 (GSH)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶 (ALT)以及考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。其他化學試劑均為國產分析純。儀器有infinite M200酶標儀;Leica-DM2500微生物顯微鏡 (德國，Leica公司)。

1.4 動物造模及用藥劑量

小鼠適應性飼養1周后，隨機分為4組 (正常對照組，模型組，蠶蛹蟲草多糖低、高劑量組(0.2和0.4 g·kg－1))，每組15只。除正常組外，其他各組小鼠每只皮下注射氫化可的松25mg·kg－1，隔日1次，共5次，正常對照組注射等容量生理鹽水。末次注射24 h后，按下述分組分別灌藥，對照組和模型組每天灌胃0.3 mL生理鹽水，蠶蛹蟲草多糖給藥組每天灌胃0.3 mL相應劑量的蠶蛹蟲草多糖 (0.2和0.4 g·kg－1)，連續灌胃21 d。

1.5 檢測動物處理方法

實驗結束前禁食12 h，各組隨機抽取10只小鼠，摘眼球取血，4℃密封靜置 2 h，3 500 r·min－1離心 15 min，取血清，4℃密封保存待檢。同時迅速剖取肝臟，冰生理鹽水沖洗、濾紙吸濕后，稱取鮮質量0.3 g左右，加預冷生理鹽水，冰水中制成10%勻漿，4℃下12 000 r·min－1離心5 min，取上清液，按試劑盒要求保存待檢。

1.6 小鼠血清、肝勻漿的生化指標檢測

AST、ALT、SOD、MDA、GSH以及考馬斯亮藍蛋白測試按試劑盒說明書測定。

1.7 小鼠肝臟組織切片標本制備

距肝臟邊緣0.5 cm處取材，10%甲醛固定后，逐級乙醇脫水、透明、浸臘、包埋、切片，HE染色。

1.8 統計方法

2 結果與分析

2.1 小鼠血清AST和ALT活性

由表1可見，氫化可的松致肝損傷模型小鼠血清AST和ALT活性顯著升高，灌胃給予蠶蛹蟲草菌絲體多糖后，可使肝損傷小鼠血清AST和ALT活性顯著下降，且呈劑量相關性，其中高劑量菌絲體多糖組 (0.4 g·kg－1)血清 AST、ALT水平與正常組無顯著差異。

2.2 小鼠血清GSH、肝臟SOD、MDA水平

表1 試驗小鼠血清AST和ALT活性的變化

氫化可的松可造成模型小鼠血清抗氧化劑GSH含量明顯下降，肝臟抗氧化酶SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高;蠶蛹蟲草多糖可顯著提高肝損傷小鼠血清GSH的含量和肝臟總抗氧化酶SOD活性，降低肝臟MDA含量至正常水平(表2)。

表2 試驗小鼠血清GSH、肝臟總SOD酶活性及MDA含量比較

2.3 小鼠肝組織病理變化

病理檢查結果顯示，正常組小鼠肝組織結構完整，無變性、壞死，肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，細胞核清晰，肝竇正常 (圖1中A)。氫化可的松致肝損傷模型小鼠肝小葉結構病變，肝索排列紊亂，細胞間無明顯分界，肝竇瘀血，肝細胞廣泛性空泡變性，呈典型的氣球樣變 (圖1中B)。蠶蛹蟲草多糖低劑量組肝小葉結構有所恢復，肝索部分排列整齊，部分細胞間仍無明顯分界，相對模型組有明顯好轉 (圖1中C)。高劑量組肝小葉結構清晰，肝索排列整齊，細胞核較清晰，肝竇無明顯異常，但有少量充血 (圖1中D)。

3 小結與討論

皮質激素氫化可的松造模是應用最廣泛的造模方法，大量的實驗研究表明，皮質激素動物模型幾乎全身所有系統均產生變化，廣泛的器官病理損害，脂質過氧化物增加和自由基清除系統功能低下等［8］。AST和 ALT是肝損傷的標志酶，在正常條件下，這些酶主要存在于細胞核和線粒體內，當細胞膜受到損傷時就會釋放入血，故血清中AST和ALT酶活性的升高為反映肝功能受損的特異性指標［9－10］。病理切片發現氫化可的松可造成小鼠肝索排列紊亂，細胞間無明顯分界，肝竇瘀血等病變［11］。本實驗從血清學和肝組織理學2方面說明小鼠肝損傷造模成功。

圖1 蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 (HE×10)

前期的研究發現許多多糖具有顯著的肝功能保護作用［12］。孫延鵬［13］等研究發現山藥多糖可降低血清中AST和ALT活性，對免疫性肝損傷小鼠具有保護作用。陳旭等［14］發現桃金娘多糖對 D-半乳糖胺致大鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用。本實驗發現，氫化可的松可導致小鼠血清AST和ALT活性顯著升高，說明模型小鼠肝損傷明顯;灌胃給予蠶蛹蟲草菌絲體多糖后，可使肝損傷小鼠血清AST和ALT活性顯著下降，且呈劑量相關性，其中高劑量菌絲體多糖組 (0.4 g·kg－1)血清AST、ALT水平與正常組無顯著差異，說明蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致小鼠肝損傷具有明顯的保護作用。

脂質過氧化是機體分子氧在氧化代謝過程中形成的活性氧中間產物，是對生物膜磷脂中多不飽和脂肪酸攻擊引起的細胞損傷過程［15］。MDA是反映機體脂質過氧化水平的重要指標，其能與蛋白質的巰基反應，導致被修飾的蛋白質和酶失去生物活性，而SOD和GSH是機體內2個關鍵的抗氧化劑［15］。本實驗研究發現，氫化可的松在引起脂質過氧化同時，減弱體內內源性抗氧化酶 (SOD)的活性及GSH含量，致使大量自由基無法清除，MDA水平顯著升高，進而引起肝細胞結構及功能損傷;蟲草多糖可明顯提高抗氧化劑 (SOD、GSH)的水平，降低MDA含量，從而減輕了因脂質過氧化加劇而造成的肝細胞損傷。肝臟石蠟切片觀察發現蠶蛹蟲草多糖明顯減輕了氫化可的松引起的肝小葉結構紊亂、肝竇淤血及肝索排列紊亂等病理變化，顯示出對氫化可的松造成的肝細胞損傷具有明顯的保護作用。本研究結果為進一步了解蛹蟲草多糖對肝損傷保護機制以及蛹蟲草的深度開發提供了基礎信息。

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S 886.9

0528-9017(2011)03-0702-03

文獻著錄格式:鄭賢林，李有貴，鐘石，等.蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致小鼠肝損傷的保護作用［J］.浙江農業科學，2011(3):702－705.

2011-03-05

浙江省重大科技攻關項目 (2004C14009)

鄭賢林 (1986－)，男，江西萍鄉人，碩士研究生，主要從事蟲生真菌研究工作。

注:計東風系通信作者，E-mail:xianlin_1986@163.com。

(責任編輯:張才德)