PPV感染Marc-145細胞后對其分泌IL-13轉錄時相的影響

劉 石，哈斯通拉嘎，王瑞寧，郭東輝，胡清林，魏戰勇

(1.河南農業職業學院，河南 鄭州 451450;2.河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450002;3.鄭州牧業工程高等專科學校，河南鄭州 450002)

PPV感染Marc-145細胞后對其分泌IL-13轉錄時相的影響

劉 石1，2，哈斯通拉嘎3，王瑞寧2，郭東輝2，胡清林2，魏戰勇2

(1.河南農業職業學院，河南 鄭州 451450;2.河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450002;3.鄭州牧業工程高等專科學校，河南鄭州 450002)

運用熒光定量PCR技術，測定和分析豬細小病毒 (PPV)感染Marc-145細胞后引起的病毒DNA含量的變化和IL-13的分泌水平。結果IL-13的表達量在1，3和24 h明顯增加，48 h輕微下調。

Marc-145細胞;白細胞介素13;豬細小病毒;轉錄時相

豬細小病毒 (Porcine parvovirus，PPV)是引起妊娠母豬繁殖障礙的主要病原體之一。初產妊娠母豬感染后，經胎盤侵襲胚胎或胎兒，引起母豬流產、胚胎死亡、胎兒畸形及木乃伊化，致使母豬不孕或反復發情，同時還可引起仔豬的皮炎和腹瀉［1］。豬細小病毒在豬群中檢出率甚高，在豬群中的血清抗體陽性率達50%～80%，給養豬業帶來巨大的經濟損失［2］。炎性細胞因子特別是白細胞介素具有介導天然免疫、調節淋巴細胞活化、生長和分化等免疫調節作用，是目前臨床醫學、免疫學和腫瘤學等領域的研究熱點之一［3］。體內白細胞介素的表達發生異常，與機體免疫功能低下或發生病理損傷有關［4］。對炎性細胞因子特別是白細胞介素表達量的準確測定，反應機體的免疫狀態、揭示疾病的發病機理、探索感染后機體的免疫應答規律均具有重要意義。常用的檢測白細胞介素等細胞因子的方法 (放射免疫法、ELISA、MTT法)不同程度上存在靈敏度不高、污染環境、費時、操作復雜和難以準確定量等缺點，對操作者和環境造成毒害的問題。實時熒光定量PCR技術以其準確、快速、定量的優點，迅速被應用于功能基因組、分子醫學、病毒學、微生物學及生物工藝學等領域［5］，也是測定在細胞因子的表達研究方面主要手段之一。我們利用SYBR Green I實時定量PCR檢測方法，分不同時間點定量檢測PPV感染Marc-145后IL-13 mRNA的表達水平，以便為研究IL-13的抗細小病毒機制提供理論參考和試驗依據，并為預防控制PPV提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

豬細小病毒7909標準毒株 (PPV-7909)購自中國獸藥監察所，病毒滴度為106.1TCID50·mL－1。

1.1.2 細胞

Marc-145細胞為本實驗室保存，細胞生長于含10%新生犢牛血清的DMEM培養基中，5%CO237℃培養。

1.1.3 主要試劑

Protein K(Promega公司);RPMI-1640培養基(GIBCOBR公司);Trypsin(Invitrogen);胎牛血清 (Hyclone公司);E.Z.N.A Total RNA KitⅠ(OMEGA);SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI Fermentas);其他常規試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

Mastercycle ep realplex Real-Time PCR 儀(Eppendorf公司);臺式高速低溫離心機 (德國Sigma公司);PTC-200型PCR儀 (M J Research公司);紫外凝膠成像系統 (美國SIM公司);小型臺式離心機 (德國Sigma公司)。

1.2 病毒感染

將Marc-145細胞用胰酶溶液分散后，培養于6孔培養板 (2×105個·孔－1)，培養細胞豐度達80%后，用PBS洗2次，將PPV接種于Marc-145，吸附60 min，期間每隔15 min輕輕晃動1次，洗去未吸附的病毒，添加含有2%胎牛血清的DMEM維持液。

1.3 細胞的收集

將病毒感染后1，3，24和48 h的細胞分別用PBS洗2次，添加0.25%胰酶消化細胞，1 000 g離心10 min收集 Marc-145細胞，保存于 －80℃備用。

1.4 DNA及RNA的提取和反轉錄

按蛋白酶K法提取病毒DNA，參照E.Z.N.A Total RNA KitⅠ說明書提取細胞總RNA，具體方法和步驟參照文獻進行［6］，以提取的總 RNA為模板進行反轉錄，反轉錄合成的cDNA及提取的DNA作為熒光定量PCR模板。

1.5 引物和相對定量PCR

引物的設計使用Primer Premier 5.0軟件，參照GenBank公布序列進行。基因名稱、參考序列、退火溫度及產物大小見表1。熒光定量PCR反應體系為 20 μL，其中 SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA 600 ng。反應條件為95℃ 1 min;95℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，共進行40個循環，循環結束升溫至95℃ 15 s，再降至60℃ 15 s，開始從60℃遞增至95℃ 20 min，采集熒光信號得出擴增產物的溶解曲線，于95℃15 s結束反應。

表1 Real-time PCR引物及其反應條件

1.6 數據處理

在實時定量PCR中，Ct值是反映模板中目標基因含量的一個重要指標，通過樣品和標準曲線Ct值比較，可以準確計算出RNA含量。另外，將目標基因與持家基因β-actin比較，消除由于收集細胞、反轉錄和加樣中操作誤差。將0 h未接種病毒的細胞因子的表達量設為1×，使用Mastercycle ep realplex Real-Time PCR軟件分析各基因相對于0 h的表達量變化水平。

2 結果和分析

2.1 病毒DNA水平測定

Marc-145單層細胞感染 PPV后，在1，3，24和48 h分別收集細胞，提取DNA，做熒光定量PCR，與β-actin進行比較分析，并將病毒感染1 h時病毒DNA含量定義為1×，得出不同時間病毒DNA在細胞的增殖倍數，結果見圖1。

圖1 PPV在Marc-145細胞中增殖規律

由圖1可知，病毒感染后1 h就可以檢測到病毒DNA，但病毒量相對較低;隨后開始逐步上升，在感染后24 h病毒開始大量迅速增殖，48 h達到最高峰，從感染后24 h的13倍增殖到170倍左右。

2.2 細胞因子的測定

Marc-145單層細胞在感染PPV后1，3，24和48 h分別收集細胞，提取 RNA，反轉錄獲得cDNA，做熒光定量PCR，并與β-actin進行比較分析，并以病毒感染0 h時mRNA含量定義為1×，得出不同時間細胞因子RNA在細胞的增殖倍數，結果見圖2。

圖2 白細胞介素IL-13的轉錄時相

由圖2可知，IL-13的表達量在1，3和24 h明顯增加，48 h輕微下降低于細胞對照水平。

3 小結和討論

實時熒光定量PCR技術是1996年由美國Applied Biosystems公司推出了一種新技術，它是利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析［7］。該技術不僅實現了PCR從定性到定量檢測的飛躍，而且所有反應均在同一溶液中進行，不需任何后處理過程，具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高、能實現多重反應、定量結果具實時性和準確性等特點［8］。目前在不同的研究領域得到廣泛的應用。

PPV可以在ST、PK-15、Marc-145等多種細胞中增殖并引起細胞病變。本研究發現在PPV感染Marc-145細胞后1 h能檢測到病毒，24 h后開始大量增殖，在感染后48 h達最高峰，達到170倍左右，這可能是由于病毒大量增殖，釋放所致。

白細胞介素 (IL)主要是由淋巴細胞產生的一類細胞因子，在傳遞信息、激活和調節免疫及在炎癥反應中起重要作用。自20世紀70年代發現IL以來，已經有33種IL相繼被發現。白細胞介素13(IL-13)是由活化的T細胞分泌的一種多效應細胞因子，在不同的細胞類型如單核細胞、B細胞、肥大細胞和角質形成細胞中功能不同。它能誘導B細胞增殖和分化，促進IgE合成，促進內皮細胞上表達某些粘附分子及抑制HIV-1病毒復制，并對某些癌細胞具有高度毒性［9－10］。具有免疫抑制和免疫調節作用，在機體免疫應答中可抑制單核、巨噬細胞產生的炎性細胞因子而具有顯著的抗炎能力，并能促進B細胞增殖和抗體的分泌［11］，在過敏性炎癥反應過程中起重要的作用［12］。IL-13能抑制IL-12產生，但能誘導Th1類細胞因子IL-2和IFN-γ 的產生［13］。

本試驗研究表明，PPV感染Marc-145細胞后IL-13的表達量在1，3和24 h明顯增加，48 h輕微下降低于細胞對照水平。Briere等［14］研究表明，IL-13不能抑制病毒進入細胞的過程，但能明顯抑制病毒蛋白和逆轉錄酶的產生，降低病毒的細胞致病性。我們推測在PPV感染 PK-15細胞后促炎細胞因子的表達先于抗炎細胞因子，在1 h時啟動抗炎細胞因子IL-13作為自我防御機制參與細胞免疫過程，細胞中IL-13 mRNA的表達水平可作為觀察病情活動狀態的一個免疫學指標。

本試驗利用熒光定量PCR測定和分析PPV感染Marc-145細胞后細胞因子mRNA表達量的變化，PPV感染后可引起Marc-145細胞分泌IL-13，且感染后1，3和24 h明顯增加。這為以后PPV分子致病機制，評價疫苗的細胞免疫效果和藥物抗病毒的藥效機制提供了試驗基礎和依據。

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S 852.4

A

0528-9017(2011)03-0710-03

文獻著錄格式:劉石，哈斯通拉嘎，王瑞寧，等.PPV感染Marc-145細胞后對其分泌IL-13轉錄時相的影響 ［J］.浙江農業科學，2011(3):710－713.

2011-03-08

河南省重點科技攻關項目 (08210213007)

劉 石 (1984－)，男，河南鄭州人，學士，主要從事分子免疫學和分子病毒學研究工作。E-mail:hnls60@126.com。

注:胡清林系通信作者。

(責任編輯:吳益偉)