高糖高脂致大鼠非酒精性脂肪肝合并高血糖動(dòng)物模型的研究

周 鑫，韓德五，李素紅，郭建紅

（1.山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，太原 030001；2.山西省腫瘤醫(yī)院，太原 030013）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率近年來(lái)不斷攀高且起病漸趨低齡化，并且已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)第一大肝病，在我國(guó)亦有望成為慢性肝病的首要病因，更為嚴(yán)峻的是，非酒精性脂肪性肝病除了與酒精性肝病一樣可導(dǎo)致肝病相關(guān)殘疾和死亡外，還與2型糖尿病、代謝綜合征及相關(guān)心腦血管事件密切相關(guān)，并被認(rèn)為是代謝綜合征的肝內(nèi)表現(xiàn)。我們的前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NAFLD在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生上發(fā)揮著重要的作用。因此，建立與人NAFLD合并T2DM形成相似并具有相同的異常代謝特征的動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究是十分必要的。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)多用高脂飲食制備NAFLD模型，但是近年來(lái)，隨著人們飲食習(xí)慣的改變，日常生活中人們?cè)诖罅渴秤萌忸愂澄铮ǜ咧┑耐瑫r(shí)也大量食入著加入蔗糖的食品（如飲料、快餐等），所以我們模擬現(xiàn)代人類的飲食習(xí)慣，采用高糖高脂飲食建立脂肪肝合并高血糖大鼠模型，為進(jìn)一步研究NAFLD在相關(guān)的Ⅱ型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用提供工具。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Spraque-Dawley大鼠64只，雌雄各半，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（晉）2009-0001］。

1.2 主要試劑和儀器

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、游離脂肪酸（FFA）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，Tch）試劑盒、內(nèi)毒素（LPS）顯色機(jī)制鱟試劑盒、腫瘤壞死因子（TNFα）放免試劑盒、胰島素（FINS）放免試劑盒、血糖（FPG）試劑盒； 721分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；SN-684型放免γ計(jì)數(shù)器：上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型的建立

64只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為8組：3月正常對(duì)照組8只（3C），6月正常對(duì)照組8只（6C），9月正常對(duì)照組8只（9C），12月正常對(duì)照組8只（12C），以正常飲食喂養(yǎng)；3月高糖高脂組（3H） 8只，6月高糖高脂組（6H）8只，9月高糖高脂組（9H）8只，12月高糖高脂組（12H）8只，采用高糖高脂膳食（70％正常飼料+20％豬油+10％蔗糖+ 1％膽固醇 +0.25％膽酸）喂養(yǎng)。正常組總熱量13.89 KJ/g，模型組總熱量68.40 KJ/g。上述各組動(dòng)物均在天黑前投食，自由飲水，每月稱體重一次。分別于實(shí)驗(yàn)第3月末、第6月末、第9月末、第12月末處死相應(yīng)階段的正常組及高糖高脂組大鼠，采腹主動(dòng)脈血，3500 r/min離心備用；取肝左葉、內(nèi)臟脂肪組織和胰腺組織于10％中性福爾馬林固定液中固定，石蠟包埋切片。肝組織、胰腺組織切片行蘇木素-伊紅（HE）和蘇丹Ⅳ染色；脂肪組織行蘇木素-伊紅染色（HE）。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè)及腹腔糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）

測(cè)定血漿 ALT、TG、Tch、LPS、TNFα、FPG、FINS （放免法測(cè)定），計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）： HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5和β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMA-β）：HOMA-β=（20×FPI）/（FPG-3.5）。腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)：于動(dòng)物2個(gè)月時(shí)大鼠禁食12 h，稱重后腹腔注射葡萄糖2 g/kg，在注射后0、30、60、90、120 min檢測(cè)血糖。

1.5 病理學(xué)檢查

10％中性福爾馬林溶液固定肝臟、胰腺、附睪部位脂肪組織標(biāo)本，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色（肝、胰、附睪脂肪）和蘇丹Ⅳ染色（肝、胰），光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變，胰腺組織病理學(xué)改變情況以及觀察脂肪組織細(xì)胞尺寸大小，每組取5張，每張取5個(gè)視野，運(yùn)用IPP6.0軟件分析脂肪細(xì)胞、胰島細(xì)胞面積大小。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重及臟器重量的變化

經(jīng)高糖高脂膳食喂養(yǎng)后，各階段模型組大鼠與正常組大鼠相比，體重、內(nèi)臟脂肪重量（用腎周和附睪或子宮周圍脂肪組織代表內(nèi)臟脂肪）明顯增加（P＜0.05），提示大鼠經(jīng)過高糖高脂飲食喂養(yǎng)可誘發(fā)大鼠發(fā)生肥胖以及內(nèi)臟脂肪的增加，見表1。

3 血脂及肝酶活性的變化

表2結(jié)果表明，經(jīng)一年高糖高脂喂養(yǎng)模型組大鼠于實(shí)驗(yàn)第三月末已出現(xiàn)高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥；肝酶ALT活性明顯升高。

表1 大鼠體重、臟器重量及其所占百分比變化Tab.1 Data of rats body weight，organ weights and other physiological index

表2 血生化指標(biāo)的變化Tab.2 Blood biochemicalmanifestation of rats in each group

表3 LPS和TNFα的變化Tab.3 LPS、TNFαin each group

3 LPS及TNFα的變化

表3結(jié)果顯示，模型組大鼠血清 Lps、TNFα從實(shí)驗(yàn)第3個(gè)月開始持續(xù)增高至第十二月末，但各階段之間未見明顯差異。

4 FINS、FPG、HOM A-IR、HOM A-β的結(jié)果及IPGTT試驗(yàn)結(jié)果

表4結(jié)果表明，模型組各階段大鼠與正常組相比，血漿 FINS、FPG明顯升高且有統(tǒng)計(jì)意義（P ＜0.05），胰島素抵抗指數(shù)與正常組相比均有顯著差異（P＜0.05），以六月份模型組大鼠胰島素抵抗指數(shù)最高。HOMA-β反映胰島β細(xì)胞功能，模型組大鼠HOMA-β以六月份出現(xiàn)代償性增強(qiáng)后進(jìn)行性衰退，提示β細(xì)胞數(shù)量減少和功能進(jìn)行性下降。IPGTT試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

5 脂肪、肝臟和胰腺組織病理學(xué)觀察

5.1 內(nèi)臟脂肪組織

高糖高脂組脂肪細(xì)胞大小與正常對(duì)照組相比明顯增大（圖2），3～12月在逐漸增大，高糖高脂組自第6個(gè)月開始脂肪組織的結(jié)締組織間已有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（彩插1圖3-圖4）。

5.2 肝臟

正常對(duì)照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常（彩插1圖5）；3～12個(gè)月高糖高脂組肝細(xì)胞的脂肪變性、氣球樣變，以及肝小葉和匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度逐漸加重；6～12個(gè)月高糖高脂組纖維組織增生逐漸加重，至第9個(gè)月出現(xiàn)假小葉，至第12個(gè)月纖維化進(jìn)一步加重并且交織成網(wǎng)，假小葉使原肝臟組織改建，最終形成肝硬化（彩插1圖6）。

表4 大鼠FBS、FINS、HOMA-IR、HOMA-β的變化Tab.4 Blood glucose，insulin，insulin resistance andβ-cell function of rats in each group

圖1 血糖對(duì)IPGTT的影響Fig.1 FPGs impact on IPGTT

圖2 脂肪細(xì)胞面積比較示意圖Fig.2 Comparison of fat cell size diagram

通過蘇丹Ⅳ染色可明顯觀察到各階段肝臟TAG沉積情況（彩插1圖7）。

5.3 胰腺

正常對(duì)照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)正常（彩插1圖8）；3～6個(gè)月高糖高脂組胰島體積逐漸增大，胰島內(nèi)血管充血乃至擴(kuò)張；9～12個(gè)月胰島周邊炎細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸顯著，胰島內(nèi)脂肪沉積也較前加重，并且有一半胰島體積明顯縮小，發(fā)生萎縮（彩插1圖9-圖10）。

圖10 胰島面積比較示意圖Fig.10 Comparison of islet area

蘇丹Ⅳ染色顯示第9月已有脂肪浸潤(rùn)。在第12月更加嚴(yán)重（彩插1圖11）。

3 討論

非酒精性脂肪性肝病與二型糖尿病都屬于代謝綜合征相關(guān)的疾病，二者之間有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，但確切機(jī)制尚未闡明。因此，理想的動(dòng)物模型對(duì)于研究人類MS相關(guān)疾病之間的關(guān)系至關(guān)重要。目前，用于非酒精性脂肪性肝病合并糖尿病研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型不多，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)多用單純高脂飲食或聯(lián)合腹腔注射鏈尿佐菌素制備非酒精性脂肪性肝病及糖尿病動(dòng)物模型［1，2］，但是近年來(lái)，隨著人們飲食習(xí)慣的改變，日常生活中人們?cè)趶V泛食用肉類食物（高脂）的同時(shí)也大量食入著加入蔗糖的食品（如飲料、快餐等），所以采用高糖高脂膳食喂養(yǎng)大鼠，觀察是否發(fā)生非酒精性脂肪性肝病及相關(guān)的二型糖尿病更符合人類的實(shí)際生活。

眾所周知，肥胖是非酒精性脂肪性肝病及糖尿病重要的致病因素［3］。高糖高脂都可誘發(fā)動(dòng)物肥胖。肥胖的個(gè)體脂肪細(xì)胞增大，肥大的脂肪細(xì)胞由于對(duì)脂質(zhì)緩沖容量變小，使許多脂質(zhì)（主要為FFA）隨循環(huán)在非脂肪組織，如肝、胰等地蓄積。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)觀察在實(shí)驗(yàn)第三個(gè)月開始已在肝內(nèi)蓄積，使肝臟發(fā)生嚴(yán)重的脂變、脂肪肝進(jìn)而發(fā)生肝炎、纖維化及肝硬化。到實(shí)驗(yàn)第9個(gè)月，由于肝臟對(duì)脂質(zhì)（包括TAG、DAG、FFA等）已趨飽和，便隨循環(huán)流向胰腺。脂質(zhì)沉積在胰腺特別是胰島β細(xì)胞可損害胰島素的生物合成與分泌、以及凋亡的發(fā)生，促進(jìn)T2DM的發(fā)生發(fā)展［4］。肥大的脂肪細(xì)胞還可使脂因子分泌異常，使TNFα、CRP等產(chǎn)生 IR的炎癥因子產(chǎn)生過量，而抑制脂聯(lián)素等使胰島素敏感的細(xì)胞因子產(chǎn)生，進(jìn)一步加重 IR［5］。另外，肥大的脂肪細(xì)胞由于血液灌注減少所以容易缺血壞死，壞死的脂肪細(xì)胞被巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步引起脂因子分泌異常，從而加重IR。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NAFLD合并T2DM的患者，主要表現(xiàn)為糖耐量減低，空腹血糖升高，高胰島素血癥和高甘油三酯血癥等特征。本實(shí)驗(yàn)中，在喂養(yǎng)高糖高脂飼料后，SD大鼠出現(xiàn)糖耐量減低、空腹高血糖高胰島素血癥高脂血癥，與人類NAFLD合并T2DM具有相似的糖脂代謝紊亂，表明本研究誘發(fā)的NAFLD合并高血糖的模型是成功的。

非酒精性脂肪性肝病與二型糖尿病都屬于MS相關(guān)的疾病，這一組疾病其本質(zhì)是低度炎癥性疾病［6，7］，其共同的基本發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗［8，9］。而糖脂毒在其中發(fā)揮著重要的作用。脂毒性（lipotoxicity）系指脂類（如TG、DAG、FFA、神經(jīng)酰胺等）從脂肪組織經(jīng)血液向肝細(xì)胞、骨骼肌、胰島β細(xì)胞等非脂肪細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，而非脂肪細(xì)胞內(nèi)沉積的脂類極易通過非氧化代謝途徑，致使細(xì)胞功能發(fā)生障礙或凋亡、壞死，產(chǎn)生脂中毒；葡萄糖毒性主要是指高血糖本身可以通過多種途徑加劇脂毒的作用，如長(zhǎng)期高糖血癥使線粒體代謝增強(qiáng)，活性氧產(chǎn)生增多而引起的氧化應(yīng)激可影響胰島素的分泌和β細(xì)胞凋亡。由于兩者常常協(xié)同發(fā)揮作用，常稱之為糖脂毒［10］。我們通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)高糖高脂飲食喂養(yǎng)大鼠血漿LPS水平明顯升高，炎性介質(zhì)TNFα顯著增高并且一直保持高水平，表明模型組大鼠存在慢性低度炎癥反應(yīng)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型組大鼠在造模3個(gè)月時(shí)血糖、血胰島素水平升高，胰島素抵抗指數(shù)明顯增加并且始終保持高水平，β細(xì)胞分泌指數(shù)在實(shí)驗(yàn)第六個(gè)月出現(xiàn)代償性升高后進(jìn)行性降低，提示大鼠在實(shí)驗(yàn)第三個(gè)月出現(xiàn)合并代謝改變的慢性低度炎癥狀態(tài)，預(yù)示早期糖尿病的發(fā)生，后期病理觀察胰島萎縮，胰島細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致分泌功能進(jìn)行性下降最終衰竭走向顯性T2DM。

綜上所述，用高糖高脂飼料喂養(yǎng)的NAFLD合并高血糖的動(dòng)物模型，雖然耗時(shí)較長(zhǎng)，但具有與人類疾病相似的發(fā)病過程、臨床特點(diǎn)，為 NAFLD與T2DM相互關(guān)系的研究提供依據(jù)。

［1］潘勤，范建高.高脂飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際消化病雜志，2009，29（4）：255-257.

［2］胡愛民，肖鳳英，鄭云.2型糖尿病并脂肪肝實(shí)驗(yàn)性大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2006，14（3）： 156-159.

［3］Goossens GH.The role of adipose tissue dysfunction in the pathogenesis of obesity-related insulin resistance［J］.Physiol Behav，2008，94（2）：206-218.

［4］van Herden NA and Schrauwen-Hinderling VB.Lipid accumulation in non-adipose tissue and lipotoxicity.Physiology and Behavior［J］.2008，94（2）：231-241.

［5］DeFronzo RA.Dysfunctional fat cells，lipotoxicity and type 2 diabetes.Int JClin Pract Suppl［J］，2004（143）：9-21.

［6］Alison LH，Nancy FS，Steven JC，et al.Elevated endotoxin levels in non-alcoholic fattyliver disease.Journal of Inflammation［J］.2010，7（15）：1-10.

［7］Nehal NM，F(xiàn)iona CM，Paul da.Experimental Endotoxemia Induces Adipose Inflammation and Insulin Resistance in Humans.Diabetes［J］，2010，59（1）：172-181.

［8］Reaven GM.Role of insulin resistance in human disease.Diabetes 1988，37（12）：1595-1607.

［9］Gianfranco P，Giovanni P，Giovanni M，et al.Nonalcoholic steatohepatitis，insulin resistance，and metabolic syndrome：further evidence for an etiologic association.Hepatology［J］.2002，35 （2）：367-371.［10］Robertson RP，Harmon J，Tran PO，et al.Glucose toxicity in

beta cells：type 2 diabetes，good radicals gone bad，and the glutathione connection［J］.Diabetes，2003，52（3）：581-587.