影響無菌苗體系建立因素的研究進展

陳麗閩，毛碧增

(浙江大學 生物技術研究所，浙江 杭州 310029)

影響無菌苗體系建立因素的研究進展

陳麗閩，毛碧增

(浙江大學 生物技術研究所，浙江 杭州 310029)

綜述無菌苗體系建立過程中外植體選擇、外植體消毒、內生菌污染控制等關鍵因素的研究進展，并對存在問題進行探討。

外植體;消毒劑;內生菌

1902年德國植物學家 Haberlandt首次提出的植物細胞全能性理論是植物組織培養的理論基礎［1］，直到20世紀60年代，Haberlandt的預言才逐步實現，被譽為“植物組織培養之父”。植物組織培養經歷了理論創建與實踐初探、技術發展與深化、產業化生產等階段，從20世紀60年代至今，各種植物快繁技術得以廣泛應用，使植物組織培養技術進入“工廠化”時代，全球涌現一大批種子種苗公司，如荷蘭的 VDE Flowerbulbs，智利南方球莖公司，美國維生種苗公司等。美國Wyford國際公司，印度American Hybird Seeds種子公司等每年的產量達到數千萬株，組培成功的植物種類多達1 500種，產業化、商品化生產的有幾百種。植物次生代謝物的開發，以及20世紀90年代轉基因技術的蓬勃發展，賦予了組織培養新的發展前景。

無菌苗的建立是植物組織培養的首要關鍵環節，是整個組織培養的起始點，外植體污染以及褐化是該環節的主要問題，決定著整個實驗的成敗。為此，我們對影響無菌苗體系建立的幾個關鍵因素研究作一概述。

1 外植體的種類

外植體 (explant)指植物組織培養中作為離體培養的材料。

植物細胞全能性是指植物體的每一個細胞都含有能發育成完整個體的全套基因，這些基因在適宜的外界條件下將按照某種特定的程序先后表達，最終分化形成一個完整植株［2］，植物的器官，組織、胚胎、細胞以及原生質體等都是常用的外植體。

幼胚是最早作為外植體的材料，早在1904年Hanning通過培養蘿卜和辣根未成熟的幼胚獲得了小苗;1926年Harlan大麥幼胚培養成功。隨著組織培養研究的深入以及被研究物種的增多，外植體的種類逐漸豐富，主要分為5大類，即胚胎培養(成熟或未成熟胚)、器官培養 (根、莖、葉、花、果)、組織培養 (頂端分生組織、側生分生組織和居間分生組織)、細胞培養 (單個的游離細胞)、原生質體培養。

組織培養已成功的常見植物:胚胎培養有水稻、小麥、大麥、玉米、豌豆、高粱、棉、紅麻、劍麻、煙草、甜菜、向日葵、棕櫚、萵苣、蔥、蘋果、梨、核果、龍眼、山楂、甜瓜、獼猴桃、松樹、百合、蘭花［3］;器官培養中根培養有胡蘿卜、掌葉大黃［4］、長春花［5］、高山紅景天［6］、光果甘草［7］、褐脈少花龍葵［8］、煙草［9］，莖培養有馬鈴薯、甘薯、木薯、煙草、甘蔗、橡膠樹、油菜、棕櫚、石刁柏、蘋果、梨、核果、山楂、葡萄、草莓、獼猴桃、香蕉、番木瓜、針葉松、海岸紅杉、楊樹、桉樹、泡桐、百合、水仙、菊花、杜鵑、蘭花［3］，葉培養有豌豆、甘薯、高粱、煙草、番茄、茄子、芹菜、百合、蘭花［3］，花培養有水稻、小麥、大麥、玉米、馬鈴薯、苧麻、紅麻、亞麻、煙草、茶樹、橡膠樹、花生、大豆、蕓苔、葡萄、番茄、茄子、石刁柏、柑橘、蘋果、荔枝、龍眼、草莓、甜瓜、西瓜、楊樹、菊花［3］，芽培養有苧麻、西瓜［3］; 分生組織培養有蔥、甘薯［10］、駿棗［11］、球根花卉 (唐菖蒲、水仙、郁金香等)［3］;原生質體培養有馬鈴薯、棉、油菜、大豆、蕓苔、番茄、茄子、萵苣、胡蘿卜、柑橘、小麥、大麥［3］。

不同品種、生長年齡和生理狀態以及同一植株的不同部位、器官和組織，植物細胞的分化再生能力具有差異。1934年White以番茄根尖為材料成功獲得第1個可以正常生長的無性系，從而使非胚器官培養首次獲得成功。隨著研究深入，研究者們發現番茄的葉片更適宜作為組織培養的材料，如目前番茄的轉基因研究常采用葉盤法［12］。

此外外植體的選擇既可以考慮實驗的可行性，也可以結合研究目的，如脫病毒。眾所周知，病毒在植物體內的分布是不均勻的。在受侵染的植株中，頂端分生組織一般說或者是無病毒的，或者是只攜帶有濃度很低的病毒［13］，故可選用莖尖分生組織作為外植體。不少文獻已有相關報道，1952年，法國人Morel將帶病毒的大麗花進行莖尖離體培養，獲得去病毒植株;1960年，Morel采用相同方法獲得了蘭屬 (Cymbidium)植物的再生植株。這一技術很快被歐美東亞許多國家的花卉生產企業所應用，實現了蘭花工業化生產，形成了特有的“蘭花工業”。1964年印度德里大學的 Guha和Maheshwari在培養南洋金花未成熟花藥時發現了由大量胚狀體形成的小植株;1967年Bourgin等從煙草花藥培養中獲得單倍體植株，證實花藥發育成單倍體植株的可能，此后花藥培養成為獲得單倍體的一條最佳途徑，成功應用于水稻、小麥等作物育種，并在改變植物遺傳性的應用研究和基礎研究中有著廣泛的應用前景［3］。

2 消毒方法以及消毒劑種類

2.1 消毒劑種類以及工作原理

對外植體表面的病原菌進行有效的消毒是無菌苗體系建立的關鍵環節，消毒劑種類的選擇應因外植體的種類而異，目前采用的比較多消毒劑為酒精、升汞、次氯酸鈉、溴水、過氧化氫等 (表1)。

表1 消毒劑的種類及其工作原理

2.2 消毒方法

外植體的消毒方法可以是消毒劑單獨使用，也可以是各種消毒劑的組合使用，但是引起組織培養污染的細菌、真菌等各種微生物，不僅存在于植物體表，甚至存在植物體內，常規的消毒一般只對植物的表面進行消毒，二步消毒法或內生菌的消毒可徹底消除組培中出現的各種污染現象。

2.2.1 表面消毒

植物體表、體內均會存在各種微生物，因此，選擇一種有效的消毒方式是組織培養實驗成敗的關鍵。

種子選用濃硫酸浸泡［14］，70% ～75%酒精 +0.1%升汞［15］，0%酒精 +10% 雙氧水［16］，70% 酒精 +10%次氯酸鈉［17］，70%酒精 +40%次氯酸鈉［18］; 莖尖選用 70% 酒精 +10% 次氯酸鈉［19－20］，75%酒精 +0.1% 升汞［21－22］，70% 酒精 +0.1% 升汞［23－24］，70% 酒 精 +20% 次 氯 酸 鈉 +0.1% 升汞［25］; 根尖適用 70% 酒精 +0.1% 升汞［26］，或種子滅菌待長出無菌根后進行組織培養［27－28］;花藥選用70% ～75%酒精+0.1%升汞［29］，70%酒精+15%次氯酸鈉［30］;葉片選用 70% ～75%酒精 +0.1% 升汞［31－33］，0.1% 升汞［34］。

70%～75%酒精與0.1%升汞的組合最常用，但要依不同的外植體適當調整消毒時間和消毒劑的濃度;次氯酸鈉也較常用，但因其具有漂白作用，不用于葉片的消毒。對葉片的消毒可以使用10%的巴氏消毒液;此外，對于帶有絨毛的外植體，為使滅菌劑濕潤整個組織，還需在消毒液中加入幾滴表面活性劑吐溫20或吐溫80。在消毒前，流水沖洗外植體數分鐘。消毒后要用無菌水將外植體沖洗干凈，以防殘液對植物細胞的傷害。

酒精消毒時要選擇適宜濃度。因高濃度酒精，會使細菌蛋白迅速脫水，造成細菌表面蛋白質首先變性凝固，形成了一層堅固的包膜，酒精反而不能很好地滲入細菌內部，以致影響其殺菌能力;酒精濃度若低于75%，會因滲透性降低而影響殺菌能力。各組培工作者的實踐經驗表明，酒精的工作濃度范圍為70%～75%，綜合考慮細菌自身的滲透勢，為此我們建議最佳工作濃度為75%。

使用氯化汞消毒，要充分把握好消毒濃度和消毒時間。因為微量的重金屬離子能在細胞內不斷累積并最終對生物發生毒害作用，或引起生物體內遺傳物質的改變。

2.2.2 內生菌消毒

控制內生菌污染是影響組培技術成功的又一關鍵因素。關于植物內生菌(endophyte)的概念范疇有著廣泛的爭議，1991年 Petrini在 Carroll和Clay提出的概念基礎上，將內生菌定義為:內生菌包括那些在其生活史中的某一段時期生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的菌，該定義還包括了那些在其生活史中的某一階段營表面生的腐生菌，對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌和菌根菌［35］。內生菌可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直接產生擴增出微生物DNA的方法來證明其內生，被感染的寄主 (至少是暫時)不表現出來外在病癥［36］。

國內在內生菌的開發應用中研究得較深入，如在制藥、植物保護、污染物降解方面，進行了菌種的分離鑒定與篩選［37］。而國外學者在內生菌污染方面的研究重點在于闡明引起其污染的原因及控制策略 (表2)。

表2 引起組織培養污染的內生菌及控制

由表2可知，通過抗生素、生物活性物質、對組培苗生長環境的控制等措施可以有效控制內生菌引起的污染問題。

3 小結

無菌苗體系的建立需要綜合考慮各種因素作用。依細胞的全能性，根據實驗目的及具體的植物種類，選擇合適的外植體;同時，選取的外植體、各種消毒劑自身的性質共同決定了采用何種消毒劑及方法;關于內生菌，黃小榮等［51］則認為:植物組培中細菌污染的原因是休眠細菌芽孢萌發的結果。

在內生菌消毒中，由于植物體中的內生細菌潛伏得較深，表面消毒無法將其消除。這種污染在外植體的初期培養中 (前幾代的繼代培養)，不易被肉眼察覺，隨著繼代培養次數的增加，菌量逐漸累積，才在培養基上顯現出來［52］。植物體內某些內生菌是與植物互利共生的，休眠的內生菌也會因培養基條件的改變而被激活［42，53］。綜上所述，要建立一個無菌苗體系，要充分考慮外植體、消毒劑、培養基等各種因素，而不能將各種因素孤立起來。

［1］ Rout G R，MohapatraA，Jain S M.Tissuecultureof ornamental pot plant:A critical review on present scenario and future prospects［J］.Biotechnol Adv，2006，24:531－560.

［2］ 王蒂.植物組織培養 ［M］.北京:中國農業出版社，2000.

［3］ 顏昌敬.植物組織培養手冊 ［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1990.

［4］ 楊世海，劉曉峰，果德安，等.不同碳源對掌葉大黃毛狀根生物量和蒽醌產量的影響 ［J］.中草藥，2005，36(37):1075－1078.

［5］ 孫敏，曾建軍.長春花毛狀根培養及抗癌生物堿產生的研究 ［J］.中國中藥雜志，2005，30(10):741－743.

［6］ 徐洪偉，周曉馥.高山紅景天毛狀根培養的研究 ［J］.中國生態農業學報，2003，11(3):45－47.

［7］ 王裔惟，丁家宜，周倩耘，等.光果甘草毛狀根培養過程中對活性氧清除能力和總黃酮含量的變化 ［J］.植物資源與環境學報，2004，13(2):6－9.

［8］ 吳曉鳳，施和平，Tsang P K E.褐脈少花龍葵毛狀根的誘導、培養及其澳洲茄胺的產生 ［J］.分子細胞生物學報，2008，41(3):184－191.

［9］ 王英娟，步懷宇，李多偉，等.煙草毛狀根誘導及其茄尼醇含量初探 ［J］.植物學通報，2006，23(34):334－340.

［10］ 張雅瓊，郭華春.甘薯莖尖分生組織培養的研究進展［J］.農業生物技術，2005，21(31):74－76.

［11］ 朱文勇，杜學梅，郭黃萍，等.駿棗莖尖培養脫除棗瘋病MLO ［J］.園藝學報，1996，23(2):197－198.

［12］ 田吉林，楊玉愛，何玉科.轉HAL1基因番茄的耐鹽性［J］.植物生理與分子生物學學報，2003，29(5):409－414.

［13］ 李浚明，朱登云.植物組織培養教程 ［M］.北京:中國農業大學出版社，2000:224－225.

［14］ 鄒利娟，蘇智先，胡進耀，等.美洲商陸組培快速繁殖［J］.中藥材，2008，31(9):129－1301.

［15］ 漆燕玲，栗孟飛，孫萍，等.桃兒七成熟胚的離體培養研究 ［J］.生物學雜志，2008，25(4):39－41.

［16］ 許亞楠，佘建明，張保龍，等.陸地棉子葉離體培養誘導不定芽植株再生 ［J］.江蘇農業學報，2008，24(5):595－599.

［17］ 邢德峰，李新玲，王全偉，等.影響大白菜高效離體培養再生的因素 ［J］.植物生理學通訊，2003，39(5):420－424.

［18］ 余波瀾，張利明，孫勇如，等.茄子子葉和下胚軸的組織培養和植株再生 ［J］.植物生理學通訊，2003，39(4):317－320.

［19］ 蔣剛強，王瑜，蘭海燕，等.水浮蓮無菌苗的獲得及其培養體系的優化 ［J］.水生生物學報，2008，32(5):615－619.

［20］ 吳林森，馮福娟，張宇，等.西蘭花離體快繁外植體消毒技術初探 ［J］.農業與技術，2006，26(3):96－98.

［21］ Zhou J，Wang B C，Zhu L Q .Conditioned culture for protoplasts isolated from chrysanthemum:An efficient approach［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2005，45:113－119.

［22］ 顧沛雯.葡萄卷葉病毒的脫毒技術研究 ［J］.西北農林科技大學學報，2008，36(5):85－91.

［23］ 段新玲，任東歲，段黃金.毛刺槐的組織培養和植株再生［J］.植物生理學通訊，2000，36(6):534－535.

［24］ 周玉珍，張雨青.金葉風箱果初代離體培養中影響外植體褐化的因素 ［J］.植物生理學通訊，2001，37(2):122－123.

［25］ 唐東芹，黃丹楓，唐克軒，等.東方百合鱗片的組織培養［J］.植物生理學通訊，2003，39(5):450－452.

［26］ 王桂英.韭菜根尖培養及植株再生 ［J］.北方園藝，2007(12):199－200.

［27］ 魯守平，孫群，楊艷春，等.烏拉爾甘草離體根尖培養方法的建立 ［J］.農業生物技術科學，2008，24(2):93－97.

［28］ 祝水金，季道藩.棉花離體根尖培養體系的建立 ［J］.棉花學報，2000，12(6):288－293.

［29］ 朱允華，劉清，吳朝林，等.菜薹花藥培養誘導胚狀體的研究 ［J］.生物技術通報，2008(2):136－139.

［30］ 王玲仙，謝吉容，付堅，等.香花槐花器官的組織培養及植株再生研究 ［J］.北方園藝，2008(1):191－193.

［31］ 胡國富，李鳳蘭，袁強，等.北青蘭 (Dracocephaluma rgunense)葉片組織培養的研究 ［J］.東北農業大學學報，2004，35(2):195－198.

［32］ 張小蘋，馬雙馬，那淑芝，等.二色補血草葉片組織培養及無性系的建立 ［J］.沈陽農業大學學報，1998，29(1):96－97.

［33］ 符文英，杜道林，符木均.海南粗框愈傷組織的誘導和培養 ［J］.植物生理學通訊.2004，40(1):34－36.

［34］ 馬國華，張靜峰，劉念，等.從多花野牡丹和野牡丹花柄直接誘導出芽 ［J］.植物生理學通訊，2004，40(6):719.

［35］ Petrini O.Taxonomy of endophytic fungi in aerial plant issues［G］ //Fokkema N J. Microbiology ofthephyllosphere.Cambridge U K:Cam bridge University Press，1986:175－187.

［36］ Stone J K，Bacon C W，White J F.An overview of endophytic microbes:endophytism defined［G］ //Bacon C，White J F.Microbial endophytes.New York:Marcel Dekker，2000:3－29.

［37］ 李強，劉軍，周東坡，等.植物內生菌的開發與研究進展［J］.生物技術通報，2006(3):33－37.

［38］ West T P，Preece J E.Use of acephate，benomyl and alginate encapsulation for eliminating culture mites and fungal contamination fromin vitrocultures of hardy hibiscus［J］.In Vitro Cell Dev Biol-Plant，2006，42:301 －304.

［39］ Abdi G，Salehi H，Khosh-Khui M.Nano silver:a novel nanomaterial for removal of bacterial contaminants in valerian(Valeriana officinalisL.)tissue culture ［J］.Acta Physiol Plant，2008，30:709 －714.

［40］ Marino G，Gaggia F，Saiano F，et al.Elimination ofin vitrobacterial contaminants in shoot cultures of‘MRS 2/5’plum hybrid by the use ofMelia azedarachextracts［J］.Eur J Plant Pathol，2009，123:195 －205.

［41］ Nagy JK， SuleS， SampaioJP. Appletissueculture contamination by rhodotorula spp:identification and prevention［J］.In Vitro Cell Dev Biol-Plant，2005，41:520 －524.

［42］ Cassells A C，Tahmatsidou V.The influence of local plant growth conditions on non-fastidious bacterial contamination of meristem-tips ofHydrangeaculturedin vitro［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult，1996，47:15 －26.

［43］ Tanprasert P，Reed B M.Determination of minimal bactericidal and effective antibiotic treatment concentrations for baceterial contaminants from micropropagated strawberries［J］.In Vitro Cell Dev Biol-Plant，1997，33:227 －230.

［44］ Luna C，Collavino M，Mroginski L，et al.Identication and controlofbacterialcontaminants from Ilex dumosa nodal segments culture in a temporal immersion bioreactor system using 16S rDNA analysis ［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult，2008，95:13－19.

［45］ Thomas P，Prakash G S.Sanitizing long-term micropropagated grapes from covert and endophytic bacteria and preliminary field testing of plants after 8 yearsin vitro［J］.In Vitro Cell Dev Biol-Plant，2004，40:603 －607.

［46］ Eudes F，Comeau A，Collin J，et al.Use of hen lysozyme for protection against bacterial contamination ofin vitroembryo cultures［J］.Plant Cell Rep，1995，15:30－33.

［47］ 翟建中，顧梅俏.長春蔓組培生產中污染的防除 ［J］.森林病蟲通訊，1999(4):30－32.

［48］ Barrett C，Cassells A C.An evaluation of antibiotics for the elimination ofXanthomonas campestrispv.pelargonii(Brown)fromPelargoniumX.domesticumcv.‘Grand Slam’explantsin vitro［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult，1994，36(2):169－175.

［49］ 何云芳，郭達初.百合及半夏試管繁殖中的污染防治初報［J］.浙江農業大學學報，1995，21(3):322－324.

［50］ Kneifel W，Leonhardt W.Testing of different antibiotics against Gram-positive and Gram-negative bacteria isolated from plant tissue culture ［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult，1992，29:139－144.

［51］ 黃小榮，楊開太.香水白掌的組織培養 ［J］.廣西林業科學，2001，30(1):39－40.

［52］ Kritzinger E M，Vuuren R J，Woodward B.Elimination of external and internal contaminants in rhizomes ofZantedeschia aethiopicawith commercial fungicides and antibiotics［J］.Plant Cell Tissue Organ Cult，1998，52:1－2.

［53］ Panicker B， Thomas P， Janakiram T，et al. Influence of cytokinin levels oninvitropropagation ofshy suckering chrysanthemum“Arka Swarna”and activation of endophytic bacteria［J］.In Vitro Cell Dev Biol-Plant，2007，43:614－622.

S 339.4

A

0528-9017(2011)03-0483-05

文獻著錄格式:陳麗閩，毛碧增.影響無菌苗體系建立因素的研究進展 ［J］.浙江農業科學，2011(3):483－487.

2010-12-09

浙江省重大科技攻關項目 (2005C13016)

陳麗閩 (1986－)，女，浙江金華人，碩士研究生，研究方向為植物組織培養以及轉基因分子育種。E-mail:liminchen@zju.edu.cn。

注:毛碧增系通信作者，E-mail:maobz@zju.edu.cn。

(責任編輯:吳益偉)