DNA分子力學性質的測量

冉詩勇，王艷偉，楊光參

（溫州大學物理與電子信息工程學院物理實驗中心，浙江溫州325035）

1 引 言

生物學與物理學的相互交融自20世紀以來已是大勢所趨.DNA作為生物學中最重要的大分子，同時受到了物理學家和生物學家的關注.生物學家更關注DNA作為遺傳密碼的生物學功能，而物理學家則將之看做受彈性理論和聚電解質理論支配的帶負電的高分子.雖然各自關注的重點不一，但兩者之間存在密切聯系.DNA的力學性質直接影響到了其生物學功能，例如在DNA重組過程中，DNA必須被拉長到其正常的右螺旋態的大約1.5倍長.

20世紀90年代初發展起來的單分子生物物理研究則為生物學家和物理學家架設了一個很好的互通橋梁.這一領域通常利用單分子實驗技術（如光鑷、磁鑷等）操縱單根DNA分子，探索如DNA力學性質，DNA與蛋白相互作用等雙方都關注的科學問題[1－3].目前這一領域仍在蓬勃發展中，及時地向物理學背景的研究生以及本科生介紹這一領域顯得尤為必要.

近年來，我們在近代物理實驗教學中利用自行研制的單分子磁鑷裝置，以測量單根DNA的力學性質為基礎實驗內容，以觀測DNA與各種作用因子作用為設計實驗內容，開設了單分子生物物理綜合設計型實驗.這一實驗既涉及到了生物學中的重要的DNA大分子，又應用了屬于研究前沿的單分子實驗技術，而物理學原理則是基本的熱力學的能量均分定理.該實驗可以很好地讓學生與研究前沿接軌，并對物理學在生物學中的應用有初步的認識.

2 實驗裝置與實驗原理

實驗裝置如圖1所示.整個實驗在一倒置顯微鏡（Nikon－TE2000U）上進行.樣品池（圖2）由2片載玻片夾住1片側面拋光的蓋玻片并用玻璃膠密封構成.上面載玻片鉆有2個直徑約1mm的小孔，玻璃管從小孔中接出并與硅膠管相連，一根硅膠管連接微注射泵，另一根接樣品溶液.通過調節微注射泵（保定蘭格）的流速和拉伸方式，可使樣品進入或流出樣品池.一端帶有磁球而另一端帶有地高辛的DNA溶液引入后可通過地高辛和抗地高辛之間的特異結合，連接在鋪好抗地高辛的拋光蓋玻片側壁上，形成如圖3所示結構.樣品池一側有安裝在手動微操縱儀上的永磁鐵，通過吸引磁球對DNA施加拉力，可以通過改變永磁鐵的位置來改變磁力大小.樣品池內顯微鏡成像通過外接CCD（維視圖像，VS－808HC）以每秒25幀成像實時傳送到計算機主機上安裝的圖像采集卡（微視圖像，MV－200），并錄像保存視頻供分析.

圖1 實驗裝置圖

圖2 樣品池

圖3 實驗設計

磁球在焦平面x方向的運動相當于阻尼擺運動.熱漲落傾向于讓小球偏離平衡位置δx，導致x方向回復力Fx＝－Fsinθ與之抗衡，這里θ為擺偏離平衡位置夾角，F為垂直于x方向的外力.由于θ較小，sinθ≈θ＝δx／〈L〉，于是有Fx≈－Fδx／〈L〉＝－kxδx，其中〈L〉為DNA的末端距長度即磁球到側壁的距離，kx＝F／〈L〉是該阻尼擺的有效勁度.這樣擺的小角度的x方向運動可以看作一維諧振子運動，其能量等于kx〈δx2〉／2，而根據能量均分定理，小球在垂直磁場方向即x方向自由度上的能量為KBT／2，這樣KBT／2＝kx〈δx2〉／2＝F〈δx2〉／（2〈L〉），得到：

其中KB為玻爾茲曼常量，T為熱力學溫度，〈δx2〉為磁球布朗運動x方向的均方差[4－6].磁球的運動軌跡利用基于快速傅里葉變換的自相關算法程序[6]分析采集的視頻得到.δx和〈L〉可通過圖像分析直接得到，并通過（1）式求得外力大小.

磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液的配制方法：16mL 0.2mmol／L的NaH2PO4·2H2O與84mL 0.2mmol／L的Na2HPO4·12H2O混合得到100mL的PBS溶液，再加入NaCl達到140mmol／L.然后對其進行過濾以待用.該緩沖液的pH值為7.5.

DNA樣品制備：采用lambda DNA（New England Biolab）用于實驗，其兩端各有12個堿基的缺口，定制與缺口互補并且分別修飾有生物素和地高辛功能基的12個堿基的寡核酸片斷，利用T4連接酶將2個片斷互補連上得到兩端修飾的DNA[7].實驗時先將DNA與2.8μm修飾有鏈親和素的順磁球（dynal biotech）混合，因為生物素與鏈親和素能夠形成共價鍵，這樣就得到了連有磁球的DNA.

3 結果與討論

圖4為分析得到的不同外力下磁球在平行于側壁方向的運動軌跡，其波動幅度直接反映了所受外力的大小.可以觀察到施加外力越大，波動幅度越小；反之則越大.對δx2進行統計平均得到〈δx2〉，進一步由式（1）可求出此時DNA所受的力的大小.對圖4所示的各種外力下的δx進行統計后，可以得到其各自的統計分布圖，如圖5所示.可以看到δx的分布滿足典型的高斯分布.力越大，分布峰值越高，半峰全寬也越窄.作為一種輔助手段，觀察δx分布是否滿足高斯分布可以判斷所采集的數據幀是否足夠多，以用于準確計算δx2的統計平均值.

圖4 不同外力作用下磁球在平行于側壁方向的運動軌跡圖

圖5 對應于圖4的不同外力下δx的統計分布（圖中每個柱狀的寬度均為0.02μm）

通過移動磁鐵改變施加的力的大小，得到了一系列DNA相對伸長量L／L0（L0為DNA完全拉直后的輪廓長度，lamnda DNA約為16.4μm）隨外力變化的數據.

在0.1～10pN范圍內，DNA的力學反應行為可以用蠕蟲狀鏈（worm－like－chain，WLC）模型來描述[8].根據該模型為：

其中KB是玻爾茲曼常量，T是熱力學溫度，L0是DNA完全舒展時的長度，F為外力，L是DNA的末端距長度，A為DNA的持久長度，是高分子物理學中用來衡量高分子剛性的一個參量.在0.2mmol／L PBS＋140mmol／L NaCl的溶液環境中，DNA的持久長度A為50nm左右.代入A值，室溫T＝298K后，作圖得到該模型函數圖，如圖6實線所示，與實驗結果符合良好.

圖6 測量得到的不同外力下DNA的相對伸長數據以及蠕蟲狀鏈模型擬合曲線

由于該測力方法原理是基于統計平均，不可避免地會出現統計誤差.如果統計數據量不足，則會造成測量的偏差.一般數據采集量宜至少大于1 500個，即采集分析1min幀率25幀／s的視頻數據，才能較好地控制偏差.采集時間超過2min即3 000幀數據后，其測力偏差不超過5%.此外，當所施加的磁力小于0.5pN時，由于磁球會靠近側壁，側壁表面可能會與之作用從而影響測量，因此實際測量中，一般將DNA的末端距長度保持在大于9μm.

在教學過程中，學生親自動手采集不同磁力大小下的實驗視頻，然后離線分析，得到DNA所受力的大小及DNA的末端距平均長度，畫出如圖6所示的數據圖，然后與蠕蟲狀鏈模型相對照.

在上述實驗的基礎上，可以進一步面向學生開展DNA與各種作用因子相互作用等直接面向科研的設計型實驗研究.通過向樣品池中導入可以與DNA相互作用的蛋白、活性劑等作用因子，分析磁球的運動可得到DNA末端距隨時間變化的曲線.分析這些曲線可以直接得到其作用機理和形成的結構信息.具體的研究實例可以參見文獻[9]和[10].

4 結束語

介紹了DNA力學性質測量的近代物理實驗.該實驗在培養學生動手和數據處理能力的同時，加深物理學專業學生對生物與物理相互交融趨勢的理解，對具體的生物物理科學研究有初步的感性認識.

[1] 冉詩勇，孫博，李明.單分子操縱與單分子生物物理[J].物理，2007，36（3）：228－235.

[2] Ran Shi－yong，Wang Xiao－ling，Fu Wen－bo，et al.Single molecule DNA compaction by purified his－tones[J].Chinese Science Bulletin，2008，53（6）：836－841.

[3] 王曉玲，張興華，魏孔吉，等.一種改進型單分子操縱裝置及其應用[J].物理學報，2008，57（6）：3905－3911.

[4] Strick，T R，Allemand J F，Bensimon D，et al.Behavior of supercoiled DNA[J].Biophysical Journal，1998，74（4）：2016－2028.

[5] 王誠泰.統計物理學[M].北京：清華大學出版社，1991：343－345.

[6] Feyman R P，Leighton R B，Sands M.費恩曼物理學講義（第一卷）[M].上海：上海科學技術出版社，2006：422－423.

[7] Smith S B，Finzi L，Bustamante C.Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads[J].Science，1992，258：1122－1126.

[8] Bustamante C，Marko J F，Siggia E D，et al.Entropic elasticity ofλ－phage DNA[J].Science，1994，265：1599－1600.

[9] Ran Shi－yong，Wang Yan－wei，Yang Guang－can，et al.Morphology characterization and single－molecule study of DNA－dodecyltrimethylammonium bromide complex[J].Journal of Physical Chemistry B，2011，115（16）：4568－4575.

[10] Wang Yan－wei，Ran Shi－yong，Man Bao－yuan，etal.Ethanol induces condensation of single DNA molecules[J].Soft Matter，2011，7：4425－4434.