光合細菌產類胡蘿卜素的條件研究與制備＊

郭 丹,孫藜瑋

(煙臺職業學院,山東 煙臺 264670)

0 引言

類胡蘿卜素是一類具有特殊功能的天然色素的總稱,廣泛存在于自然界的動物、植物、真菌、藻類和細菌中。類胡蘿卜素的抗氧化作用,遠遠高于維生素E和維生素C,成為受國際藥物、膳食補充劑、功能食品界等廣泛關注的新型抗氧化活性物質,被譽為21世紀抗氧化劑時代的“新貴”[1]。

目前提取類胡蘿卜素的途徑很多,其中最常用的有兩種:一是用培養鹽藻來提取類胡蘿卜素,這種方法需要在高鹽份的海域環境,所以只能在少數地區養殖,生產的局限性很大,不宜大范圍推廣;二是用微生物發酵法生產類胡蘿卜素,目前能夠發酵產生類胡蘿卜素的微生物主要有真菌、細菌和酵母菌等[2-3]。

光合細菌(Photosynthetic bacteria)是生產類胡蘿卜素的主要微生物,因其生產周期短,不受季節限制,而且菌體含有豐富的蛋白質,色素提取后的殘留物可用作餌料、飼料等而備受科學工作者的重視。為了便于光合細菌中類胡蘿卜素的大規模開發和利用,本文將對光合細菌的生長條件及所得類胡蘿卜素制品的性質進行研究[4-5]。

1 培養基的配制[6]

1.1 RCVBN培養基(固體/液體):

無機鹽溶液 10%

微量元素溶液 0.1%

生長因子溶液 0.1%

20%DL-蘋果酸溶液 2%

20%(NH4)2SO4溶液 0.5%

磷酸緩沖液 1.5%

p H 6.8

121℃滅菌 20分鐘

(1)無機鹽溶液(1000m l)

M gSO4·7H2O 2.0g

CaCl2·2H2O 0.75g

FeSO4·7H2O 0.12g

EDTA 0.2g

p H 6.8

(2)微量元素溶液(250m l)

H3BO30.7g

M nSO4·H2O 0.398g

NaMoO40.188g

ZnSO4·7H2O 0.06g

Ca(NO3)2·3H2O 0.01g

p H 6.8

(3)磷酸緩沖液(1000 m l)

KH2PO440g;

K2HPO460g。

(4)生長因子溶液(100m l)

生物素 1.5mg;

鹽酸硫胺素 100mg;

尼克酸 100mg;

對氨基苯甲酸 100mg;

p H 6.8。

(5)20%DL-蘋果酸溶液(100m l)

20g DL-蘋果酸,用約1/3體積12N NaOH調至p H值6.8。

(6)20%(N H4)2SO4溶液(100m l)

20g的(N H4)2SO4溶液以12N NaOH調至p H值6.8。

1.2 乙酸鈉乙酸銨培養基

無機鹽溶液10%,微量元素溶液0.1%,生長因子溶液0.1%,磷酸緩沖液1.5%(以上溶液的配制同RCVBN培養基),乙酸鈉1g,乙酸銨1g,蒸餾水1L,p H=6.8,121℃滅菌20min。

1.3 乙酸鹽培養基

乙酸鈉2g,KH2PO40.5g,K2HPO40.5g,M gSO4·7H2O 0.2g,CaCl20.14g,NH4Cl 0.8g,NaCl 0.1g,酵母膏0.5g,水1L,p H=7.0,121℃滅菌20min。

1.4 YP培養基

蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl 5g,p H=6.8,121℃滅菌20m in。

2 菌種培養

2.1 菌種活化

取冰箱冷藏菌種在 YP培養基平板上劃線,25-28℃,800lx白熾燈光照培養48小時。

2.2 分離純化

在YP培養基平板上去紅色單菌落重新劃線,直至得到純培養。

2.3 液體種子培養

用RCVBN培養基洗下斜面上的菌苔,液體培養3天。

2.4 液體擴大培養

按10%接種量擴大培養,比較RCVBN、RCVBN-乙酸鈉、乙酸鹽培養基三種培養基的培養效果。

3 光合細菌培養條件的選擇

(1)菌種于30μE/m2·s光照條件下靜置培養,接種量分別為10%和25%,定時測定培養液在660nm和485nm處的OD值,以OD660來表示培養液中細菌的生物量,以OD485來表示其中類胡蘿卜素的相對含量,描繪細菌的生長曲線。

(2)菌種于30μE/m2·s光照條件下分別進行靜置培養和搖瓶培養,檢測其生長狀況。

(3)菌種分別在6,16,30,40,60μE/m2·s光照條件下靜置培養,于24h和48h時測定菌液的光吸收值,分析光照對細菌生長的影響。

4 色素的提取

4.1 收集菌體

6000rpm離心收集培養好的紅褐色菌液15min,棄去上清液,用生理鹽水洗滌2—3次,得到深紅色菌體。

4.2 抽提色素

(1)丙酮:甲醇抽提法[7]

將菌體用丙酮:甲醇(體積比7:2)懸浮,并加入相當于10%甲醇量的 KOH,懸浮液總量約20m l/1.5g菌體,加入索氏提取器進行減壓加熱(60℃水浴),回餾2h以上。

加入少量無水硫酸鈉振蕩,-20℃靜置后,取出上清液,7000—8000rpm離心去除菌體和蛋白質,減壓蒸餾,得到色素粗制品粉末,-20℃過夜。

將粗制品溶于少量石油醚中,加入等體積的甲醇,室溫下放置1—2h,去除下層甲醇后,上層用5% NaCl溶液洗滌3次,于40℃下減壓抽干石油醚,即得類胡蘿卜素精制品。

(2)石油醚:甲醇抽提法

用石油醚:甲醇(體積比2:1)懸浮菌體,加10%甲醇量的KOH,20 m l懸浮液/1.5 g菌體,加入索氏抽提器加熱回餾2—3h,蒸出大量石油醚和少量甲醇,直到回餾明顯減弱為止。

加入少量無水硫酸鈉于抽提液中,-20℃放置后,觀察到抽提液分兩層,上層墨綠,下層淺綠為菌體、蛋白質和甲醇抽提液。

加石油醚于抽提液中,振蕩充分,靜置使其分層;若分層不明顯,可依次加入甲醇和水,振蕩后靜置分層。取出上層石油醚,將下層溶液再用石油醚抽提,重復2—3次,直至石油醚層顏色基本消失,將石油醚溶液依次用甲醇和水洗滌2—3次。最后,減壓抽干石油醚,即得產品。

5 結果分析與討論

5.1 培養條件對菌種生長和色素形成的影響

(1)由圖1,2,3可以看出,菌種延緩期長短與接種量有很大的影響,二者成反比,而微好氧的搖瓶培養可縮短延遲期,使菌體很快繁殖,達到穩定期,因為在有氧條件下,菌體可進行 TCA循環,代謝較快,一般搖床培養28小時即可,而靜置培養須40小時以上。由于類胡蘿卜素的生成隨光照強度增加而降低,因此光照不宜過強,且菌體在光照3000lx下產量并不具有優勢,只是在光照強度提高時,有助于菌體迅速達到穩定期,因此光照以1500lx左右為佳。

圖1 光合細菌的生長曲線及類胡蘿卜素的產生

圖2 光照對細菌生長的影響

圖3 靜置培養與搖瓶培養的比較

(2)由三種培養基:乙酸鹽培養基、RCVBN培養基、乙酸鈉乙酸銨培養基比較可見,在乙酸鈉乙酸銨和RCVBN培養基中菌體生長旺盛,乙酸鹽培養基中菌體含量很少,但很容易收集;RCVBN培養基中由于缺乏乙酸鹽或丙酸鹽等抑制雜菌生長的成分,培養基中有大量白色雜菌形成的菌團懸浮,表面有白色菌膜,易于污染雜菌;并且RCVBN培養液離心時的菌體沉淀效果遠不如乙酸鹽和乙酸銨培養基,前者離心時轉速以8000—10000 rpm效果為佳,而后二者在轉速4000 rpm時菌體沉淀的效果就較為徹底;再者, RCVBN培養基中以蘋果酸為碳源,蘋果酸價格昂貴,不宜于大規模使用。

光合細菌體積小,收集菌體過程中的動力消耗很大,而某些可以自然沉降的菌株又不能充分利用培養基,繁殖緩慢,菌體含量少。因此,便于收集菌體的價格低廉的培養基對于簡化生產工藝,降低生產成本,大規模生產類胡蘿卜素具有重要意義。

(3)使用乙酸鈉乙酸銨培養基培養菌株時,4000 rpm離心15分鐘后,用兩種不同的色素抽提方法提取類胡蘿卜素。

5.2 色素提取的結果分析

(1)菌體用丙酮:甲醇提取時,二者均可破壞細胞膜,使細胞破裂,而丙酮對類胡蘿卜素的抽提有利,甲醇有利于葉綠素的提取;抽提后加入無水硫酸鈉可以出去抽提物中的蛋白質等極性物質;10%的甲醇量的KOH是起皂化作用,除去油脂類;最后用甲醇洗去石油醚中的殘余葉綠素,加入可促進石油醚和甲醇分層。

(2)類胡蘿卜素的經典抽提方法多采用丙酮:甲醇抽提,與石油醚:甲醇抽提法相比,有以下問題:

A.由于石油醚和甲醇不相溶,抽提后可以直接將二者進行分離,不須像丙酮那樣,抽提時需要蒸干抽提液,大大簡化了操作程序。

B.石油醚沸點低于丙酮,抽提方便,減壓抽干時也迅速,抽提溫度、時間與丙酮:甲醇抽提法相比,對色素的破壞也較輕。

C.石油醚不溶于水,可以輕易除去色素的石油醚溶液中的水分,易于抽提和減壓蒸餾,而丙酮則溶于水,抽提前需要先干燥菌體,否則將會因所含有的水分難以抽干。

D.在使用石油醚抽提法時應注意:由于石油醚不能使細胞變性、破碎,因此最好加大甲醇的用量。

(3)最終得到的色素石油醚溶液中,如果漂浮有白色絮狀蛋白質等雜物,可用水洗滌除去,而溶液中的少量水珠需仔細除凈,以免影響減壓抽干。

(4)石油醚:甲醇抽提法所得類胡蘿卜素產量可達 170mg/L培養液,而丙酮:甲醇抽提法只有71.2mg/L培養液。

6 結論

(1)對光合細菌的培養條件進行研究后,發現適當增加菌種的接種量和光照強度、以及好氧培養,均會提高光合細菌的生長速度。

(2)采用石油醚-甲醇抽提法對菌體中的類胡蘿卜素進行提取,最終獲得的類胡蘿卜素產量為170mg/L培養液,菌體濕重為7.5g/L培養液;而丙酮:甲醇抽提法只有71.2mg/L培養液。

[1]尤新.類胡蘿卜素功能和國際發展動向[J].中國食品質量報,2009,18(10):62-24.

[2]沈國鵬,徐貴敏,劉芳.脂溶性類胡蘿卜素的提取及其穩定性研究[J].河南農業科學,2003,(8):21-23.

[3]曾宇,秦松,梁明山.光合細菌綜合應用新進展[J].水產科學,2000,19(5):34-36.

[4]楊麗飛,鄧宇.光合細菌在色素提取中的應用[J].中國食品添加劑,2003,(6):93-95.

[5]劉揚,錢新民,高培基.應用均勻設計方法改進光合細菌類胡蘿卜素生產[J].山東大學學報,2004,24(1):65-68.

[6]陳德明.光合細菌產類胡蘿卜素條件優化及其穩定性研究[D].南京:南京農業大學,2007.

[7]李勤生,王若雪.光合細菌 H-3菌株色素分析[J].水產生物學報,2003,4(4):44-46.