人參皂苷對糖尿病大鼠腎組織基質金屬蛋白酶9及Ⅳ型膠原表達的影響

蘇建明 倪海祥 黃 琦 朱 鋒

浙江省中醫院（浙江杭州310006）

糖尿病腎?。―N）特征性的病理改變是細胞外基質（ECM）在腎小球、腎小管積聚導致腎小球硬化和腎間質纖維化［1］，而ECM的堆積是由于ECM產生過多和降解減少所致?；|金屬蛋白酶及其組織抑制因子表達和活性的改變，與ECM堆積關系密切?；|金屬蛋白酶9（MMP-9）參與血管基底膜主要結構成分-Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）的降解，與DN的關系密切［2-3］。本實驗采用免疫組織化學方法對糖尿病時腎組織MMP-9和Col-Ⅳ表達改變進行研究，并用人參皂苷進行干預，以探討期防治DN的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 動物：健康雄性SPF級SD大鼠100只，12周齡，體質量（300±20）g，購自中國科學院上海實驗動物中心，由浙江中醫藥大學SPF動物房飼養。試藥：人參皂苷，由浙江省中醫院制劑科提供；鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；一抗，鼠抗人（MMP-9 和 Col-Ⅳ）抗體；二抗，羊抗鼠抗體；MMP-2、Col-Ⅳ，均購自北京中山生物制品有限公司。

1.2 模型制備 隨機留取正常對照組18只，其余隨機36只大鼠禁食過夜后，按70mg/kg，左下腹腔內一次性注射1%STZ溶液 （pH 4.5的0.1mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液在冰浴中新鮮配制）。注射后72h，用血糖儀測定尾尖血血糖，血糖≥16.7mmol/L的大鼠判定為糖尿病大鼠。

1.3 分組與給藥 將模型大鼠隨機分為模型組（18只）和人參皂苷組（18只）。人參皂苷組灌胃人參皂苷0.5g/kg（溶于10%纖維素鈉溶液），模型組和正常對照組灌胃等量生理鹽水。每日2次。

1.4 標本采集 每周用血糖儀測尾尖血血糖，稱體質量，并計算水和食物的攝入量。至實驗第2、4、8周時每組各取6只大鼠留取尿液，苯巴比妥麻醉后行股動脈放血處死，留取股動脈血并取右腎稱質量。右腎與體質量的比值作為腎臟肥大程度的指標。尿液用于測定尿肌酐、尿白蛋白測定，并用尿白蛋白與尿肌酐比值作為臨床腎損害的指標。股動脈血用于測定血糖、C肽、肌酐。

1.5 標本處理與免疫組化染色 大鼠腎臟經10%甲醛固定，梯度乙醇逐步脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片（厚2μm）。石蠟切片經二甲苯脫蠟后作PAS染色、HE染色以及MMP-2、Col-Ⅳ免疫組化染色，E法。一抗均為鼠抗人（MMP-9和Col-Ⅳ）抗體，二抗為羊抗鼠抗體，MMP-9的工作滴度為1∶80，Col-Ⅳ工作滴度為1∶100。每次實驗均設PAS（空白對照）和正常兔血清取代一抗（陰性對照）。光鏡觀察腎組織病變與MMP-9、Col-Ⅳ的分布，免疫組化染色以細胞漿膜或間質有棕黃色顆?；蚓€狀沉積為陽性，否則為陰性。MMP-9、Col-Ⅳ定量均采HPIAS-21000型高清晰度彩色病理圖文報告分析系統在高倍鏡下計算其陽性面積百分比（%），每張切片選取10個視野，求平均值。

1.6 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，多樣本均數的兩兩比較采用單因素方差分析，如果方差齊采用LSD，方差不齊采用Tamhane’sT2。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 STZ注射72h后，大鼠的血糖均≥16.7mmol/L，并逐漸出現多飲、多尿、多食，體質量增長緩慢等糖尿病癥狀。與正常對照組相比，血糖、腎臟肥大指數均升高，體質量、C肽顯著下降，尿白蛋白排泄量有升高，但無統計學意義。人參皂苷治療對體質量、腎臟肥大、尿白蛋白排泄有改善作用，但與模型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1；但其對血糖、血脂作用明顯，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），與國內外相關研究結論一致［4-6］。見表2。

2.2 病理組織變化 HE染色下腎臟結構清楚，細胞核呈藍色，胞漿呈粉紅色。PAS染色下正常對照組未見明顯的腎小球系膜增生及基底膜增厚，模型組8周時可見腎小球系膜輕度增生、腎小管輕度顆粒樣變、基底膜輕度增厚，但未見腎小球結節樣增生和動脈玻璃樣變性等典型的糖尿病腎臟改變，人參皂苷組上述病變程度更輕。模型大鼠腎組織MMP-9的組織定位MMP-9抗原免疫組化染色示棕黃色或深棕黃色，主要表達在大鼠腎小球系膜細胞、內皮細胞、包曼氏囊壁層上皮細胞、腎小管上皮細胞，偶見浸潤的巨噬細胞和中性粒細胞表達。

表1 各組大鼠一般情況比較 （±s）

表1 各組大鼠一般情況比較 （±s）

與正常對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。 下同。

組 別C肽正常對照組（n=6）2周4周體質量（g）227．6±43．9 267．8±47．6肥大指數（g/kg）3．8±0．12 3．7±0．51（ng/L）2．26±0．55 2．50±0．56 8 周 294．5±66．8 3．2±0．182．60±0．73 0．97±0．09*尿白蛋白肌酐（μg/mg）1．95±0．50 2．02±0．77 2．76±0．67 2．18±0．59模型組（n=6）2 周 176．8±26．2* 6．2±1．24*4 周 180．1±39．8* 6．0±0．41* 1．14±0．30* 2．33±0．95 8 周 188．2±40．4* 6．8±0．72* 1．57±0．63* 3．77±1．36人參皂苷組（n=6）2 周 176．2±21．8* 5．1±0．64* 1．44±0．37* 2．14±0．85 4 周 175．3±12．1* 5．8±0．42* 1．69±0．56* 2．32±0．73 8周197．8±20．5*6．7±0．71*1．26±0．49*2．85±0．78

表2 各組大鼠血清糖脂代謝指標比較 （mmol/L，±s）

表2 各組大鼠血清糖脂代謝指標比較 （mmol/L，±s）

人參皂苷組（n=6）4 周 19．06±3．82**△ 6．8±1．02* 1．69±0．56* 2．32±0．73*8周21．02±4．21**△7．7±1．08*△1．26±0．49*△2．85±0．78*△

2．3 各組大鼠腎組織MMP-9、Col-Ⅳ表達比較 見表3。糖尿病大鼠腎小球MMP-9在2、4、8周時較對照組明顯下降 （P＜0．05），人參皂苷組腎小球 MMP-9高于糖尿病組，在 4、8周時差異有統計學意義 （P＜0．05）。組內比較發現模型組大鼠在4、8周時腎小球MMP-9較2周時低（P＜0．05），而人參皂苷組則在4、8周時腎小球MMP-9較2周時高（P＜0．05）。各時期模型組腎間質MMP-9與正常對照組相比，有升高但差異無統計學意義（P＞0．05），人參皂苷組較模型組腎間質MMP-9有下降，第8周時差異有統計學意義 （P＜0．05）。糖尿病大鼠腎小球Col-Ⅳ的表達在 2、4、8 周時均較正常組升高（P 均＜0．05），而腎間質 Col-Ⅳ的表達在8周時較正常組明顯升高（P＜0．05）。人參皂苷組腎小球Col-Ⅳ的表達則較模型組下降，在4、8周時差異有統計學意義（P＜0．05），腎間質 Col-Ⅳ的表達也較模型組下降，在 8周時差異有統計學意義（P＜0．05）。

表3 各組大鼠腎小球MMP-9、Col-Ⅳ表達比較 （%，±s）

表3 各組大鼠腎小球MMP-9、Col-Ⅳ表達比較 （%，±s）

組 別 腎小球 腎間質MMP-9 Col-Ⅳ MMP-9 Col-Ⅳ正常對照組（n=6）2周4周0．73±0．07 0．46±0．03 1．45±0．30 1．53±0．32模型組（n=6）人參皂苷組（n=6）8 周 0．40±0．03 2 周 0．29±0．11*4 周 0．11±0．03*8 周 0．13±0．04*2 周 0．33±0．08*4 周 0．56±0．08*△1．85±0．28 3．08±0．69＊3．01±0．38*3．41±0．41*2．25±0．32*2．33±0．41*△8周0．71±0．09*△2．79±0．35*△1．24±0．07 0．19±0．04 1．13±0．09 0．19±0．05 1．79±0．28 0．25±0．11 1．98±0．29 0．17±0．01 1．67±0．37 0．22±0．06 2．33±0．23 0．59±0．06 1．28±0．17 0．18±0．03 1．47±0．08 0．22±0．02 1．37±0．13*△ 0．27±0．07△

3 討 論

本研究用STZ制成糖尿病大鼠模型，并用人參皂苷治療，用免疫組化方法檢測腎小球及腎間質MMP-9和Col-Ⅳ表達的變化。發現糖尿病時腎小球MMP-9的表達下降，Col-Ⅳ表達上升，且隨病程進展愈加明顯。本研究發現糖尿病大鼠模型中MMP-9在腎小球中的表達是降低的，這與其他相關研究［7］結果一致。但同時發現糖尿病大鼠腎間質MMP-9的表達增加，而與Col-Ⅳ表達成正比?？赡艿氖窃谀I小球中，高血糖所致的諸多因素導致MMP-9的表達下降在先，從而引起Col-Ⅳ的降解減少，Col-Ⅳ的積累增加，導致腎小球硬化的發生。

人參為臨床上治療糖尿病的常用中藥，具有大補元氣，補脾益肺，生津止渴，安神益智之功效。既合“消渴”的基本病機“陰虛為本”，亦治久病及腎之下焦虛寒、陰陽兩虛。本研究觀察了人參皂苷對2型糖尿病實驗大鼠相關指標2周、4周、8周的影響，提示人參皂苷對腎臟的保護作用也可能通過減少ECM的形成起到保護腎細胞的作用。

由于各方面條件的限制，本研究例數尚少，此外，MMPs的表達調節大致可以分為基因水平的調節，酶原活化調節，活化后調節等調節方式［7-10］。相關藥物能否作用于在這幾個環節從而調節MMPs的表達尚待進一步研究。由于人參皂苷成分較多，其療效是多耙向的，故其治療2型糖尿病的機制相對較復雜，確切機制尚不明確，有待于在進一步的研究中篩選提取方式，闡釋其作用機理，尋找答案。

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