Hedgehog信號通路對胰腺癌細胞上皮間質轉化的調控作用

謝昆 田孝東 楊尹默

·綜述與講座·

Hedgehog信號通路對胰腺癌細胞上皮間質轉化的調控作用

謝昆 田孝東 楊尹默

Hedgehog(Hh)信號通路及上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)調控細胞的增殖和分化，在胚胎發育過程中均發揮重要作用。正常成人組織中二者活性均明顯下降，其異常活化往往與惡性腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移密切相關。在胰腺癌細胞中常發現有Hh信號通路的異常活化和EMT現象，本文就Hh信號通路調控胰腺癌細胞EMT的作用及其機制做一綜述。

一、Hh信號通路與胰腺癌

Hh信號通路主要由分泌型蛋白配體Hedgehog(Hh)、細胞膜受體Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)以及轉錄因子Gli構成，在干細胞自我更新、細胞分化、胚胎發育及組織修復等過程中發揮重要作用[1]。近年研究發現，Hh信號通路在腫瘤發生和發展中起著至關重要的作用，其中的多種基因(Hh、Ptch、Smo及Gli)被視為原癌基因或腫瘤抑制基因，在胰腺癌、基底細胞癌、肝癌、肺癌、髓母細胞瘤及前列腺癌等多種類型的惡性腫瘤中均可觀察到Hh信號通路的異常激活[2]。人胰腺癌組織及胰腺癌細胞系中均存在Hh信號通路的異常活化，且與胰腺癌細胞增殖能力相關。應用Hh信號通路特異性阻斷劑環巴明(Cyclopamine)在體內外實驗中均可顯著抑制腫瘤細胞的增殖。

Hh信號通路與胰腺癌的發生存在相關性。Morton等[3]建立了Pdx-Shh轉基因小鼠模型，發現異常活化的Hh信號通路可誘導小鼠胰腺發生異常的管狀結構，類似人PanIN-1/2的表型結構，這表明Hh信號通路與胰腺癌前病變的發生有著密切關系，同時這些異常的管狀結構也含有K-ras基因突變和HER-2/neu的過度表達。Pasca di Magliano等[4]建立了Pdx-1Cre、CLEG2、K-rasG12D轉基因動物模型，發現Ras通路和Hh信號通路的同時活化可誘發PanIN病變，并在早期形成胰腺癌，證明Hh和Ras通路在胰腺癌發生的早期階段共同發揮重要作用。研究認為，Hh信號通路主要參與細胞周期的調控，通過促進胰腺腫瘤細胞增殖和抑制凋亡發揮作用。同時有研究顯示，Hh信號通路還與Wnt、Notch、TGF-β及EGFR等多個腫瘤相關的信號通路存在著廣泛的交互作用[5-6]。

Hh信號通路亦參與胰腺癌的侵襲、轉移過程。Feldmann等[7]報道，Gli1的過度表達導致胰腺癌細胞侵襲性和轉移性增高。使用環巴明后，腫瘤的侵襲能力明顯減弱，接受環巴明治療的7只種植腫瘤小鼠中，只有1只出現肺的微轉移灶，而未給藥組小鼠全部出現肉眼可見的轉移灶。環巴明和吉西他濱聯合給藥組所有小鼠均未出現轉移灶，并顯著縮小了原發腫瘤的大小，表明抑制Hh信號通路能顯著抑制胰腺癌的生長、侵襲及轉移[8]。

二、EMT在胰腺癌侵襲、轉移中的作用

EMT是指在某些特殊的生理或病理條件下具有極性的上皮細胞失去極性，轉換成具有遷移能力、能夠在細胞基質間自由移動的間質細胞的過程[9]。EMT以上皮細胞極性的喪失及間質特性的獲得為重要特征，同時細胞表型發生改變，E-鈣粘素(E-cadherin)、細胞角蛋白(Cytokeratin)、α-連環素(α-catenin)、β-連環素(β-catenin)、γ-連環素(γ-catenin)、橋粒斑蛋白、緊密連接蛋白、黏蛋白等上皮表型標志物逐漸喪失，而波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)、N-鈣粘素(N-cadherin)、α-平滑肌動蛋白(α-SMA)等間質表型的表達上調。在胰腺的胚胎發育期，EMT在胰腺內分泌細胞形成胰島的過程中有著重要作用[10]。此外，在創傷修復的生理過程中，EMT也極為活躍[11]。

目前廣泛認為，黏附分子E-cadherin表達的變化在EMT過程中有著至關重要的作用[12]。E-cadherin的分子之間通過細胞外的免疫球蛋白結構域相互形成鏈接，并通過胞質內的α、β-catenin與肌動蛋白骨架相連，可以形成穩定的細胞間接觸；其表達減少，可導致細胞間連接解體，細胞分散，角蛋白為主的細胞骨架轉變為波形蛋白為主的細胞骨架，E-cadherin逐漸被N-cadherin所取代，細胞骨架的重排引起細胞表型的改變，細胞運動能力增強。

EMT是上皮來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性，失去了與基底膜的連接等上皮表型，獲得了具有較高遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質等能力的間質表型。從而使腫瘤形成局部浸潤和遠處轉移，并再次通過間質-上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition，MET)定植形成轉移灶。近來有很多研究證實，在包括結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌及宮頸癌等多種腫瘤侵襲轉移的過程中均觀察到EMT的發生，而且腫瘤組織中發生EMT的腫瘤細胞數量直接與其侵襲轉移程度有關[13-14]。

近年來研究發現，Twist、Snail、Slug、Sip1及NF-κB等多種轉錄因子的表達均可以促進EMT，在腫瘤細胞的轉移中起著重要作用。其中Snail是最重要的EMT誘導因子，Snail(Snai1)和Slug(Snai2)都屬于鋅指蛋白Snai超家族，它們含有鋅指結構的DNA結合蛋白，可以識別并與E-cadherin啟動子部位的E-box結合，抑制E-cadherin的表達，上調FSP1、Vimentin和Rho等表達，促進EMT的發生[15]。Snail高表達的惡性腫瘤多分化較差、侵襲能力較強、易發生轉移和復發，被認為是一個反映惡性腫瘤預后不良的重要生物學標記物。Twist屬于堿性螺旋-環-螺旋蛋白家族，是一個高度保守的轉錄因子，可以調節胚胎發育中的組織重建，并賦予細胞遷徙的能力。研究發現，Twist也可與E-box序列結合，下調E-cadherin和β-catenin等黏附連接蛋白表達，激活間質標記物，從而促進EMT的發生[16]。NF-κB可與Vimentin基因啟動子調節序列結合，并促進Twist表達，誘導EMT的發生。NF-κB還可以上調ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)的表達，ZEB1可抑制多種重要的上皮分化和細胞黏附因子，抑制E-cadherin的表達，誘導EMT發生[17]。Maier等[18]在乳腺癌模型的研究證明，在誘導和維持EMT的過程中，NF-κB信號通路是必需的；抑制NF-κB可以阻止EMT的發生。相反，激活NF-κB則可以促進上皮細胞向間質細胞轉變。Sip1也是一種鋅指蛋白，也可以抑制E-cadherin的表達，與Snail的結合序列有部分重疊。在某些E-cadherin缺失的人類癌細胞系中，Sip1呈高表達；另外，某些E-cadherin啟動子高度甲基化的細胞系亦高表達Sip1[19]。

許多信號轉導通路也參與EMT的調節，包括Ras、Wnt、Notch、Hedgehog、Rho家族激酶及TGF-β、生長因子受體等[20]。目前認為，腫瘤細胞發生EMT是微環境中作用因子和腫瘤細胞相互作用的結果，作用因子通過與細胞表面特異受體結合而將細胞外信號轉入細胞內，通過胞內的Ras、Wnt、Hh、Notch、TGF-β和生長因子受體等信號轉導途徑，活化Snail、Twist等核內轉錄因子，調節下游基因的表達，最終使腫瘤細胞更富于侵襲性而利于進一步發生轉移。

EMT過程與胰腺癌的侵襲、轉移密切相關。Nakajima等[21]研究發現，胰腺癌組織中N-cadherin表達明顯上調，在原發腫瘤部位和肝轉移灶中表達率分別為43.3%(13/30)和53.3%(8/15)，其表達與腫瘤神經浸潤顯著相關，而Vimentin則主要表達在肝轉移灶中。此外，很多研究發現EMT過程與胰腺癌干細胞關系密切。Dembinski等[22]在分離出的DiI+/SCC細胞群，Kabashim等[23]在SP細胞亞群均發現存在明顯增強的EMT過程，認為EMT現象與腫瘤干細胞侵襲性增加相關。

三、Hh信號通路調控胰腺癌細胞EMT的作用及機制

Hh信號通路介導EMT發生的機制目前雖不甚明確，但研究表明兩者之間有一定的相關性。研究發現，EMT過程中的重要轉錄因子Snail可能為Gli1蛋白的下游轉錄調控靶點。Li等[24]在皮膚癌的研究中發現Hh信號轉導通路中的下游轉錄因子Gli水平的升高可迅速上調Snail的表達，Snail可進一步介導E-cadherin表達水平下調，促進EMT的發生。Feldmann等[7]胰腺癌的研究中也報道Hh通路下游因子Gli1過度表達，可促進Snail的表達上調，使E-cadherin表達明顯下調，促進EMT的發生，導致腫瘤細胞侵襲性和轉移性增高；使用環巴明后，Snail水平明顯下調，而E-cadherin表達水平明顯上調，腫瘤的侵襲能力明顯減弱。

EMT相關轉錄因子Sip1的啟動子區域也具有Gli1蛋白的轉錄調控DNA結合位點。Ohta等[25]使用小干擾RNA技術沉默Gli1后胃癌的Sip1蛋白的表達相應下調，但并未發現Sip1可下調EMT過程中的重要蛋白E-鈣粘素(CDH1基因)的表達。然而目前尚無證據表明胰腺癌細胞中Hh信號通路可直接調控Sip1表達進而調控EMT過程。

Li等[26]報道，Hh信號轉導通路的異常活化可迅速上調Wnt家族如Wnt2b、Wnt7b等的表達，間接激活Wnt通路，與Snail協同作用于β-catenin，破壞E-cadherin-β-catenin復合物，并抑制蛋白激酶GSK-3β對β-catenin的降解作用，使β-catenin在細胞內積聚并重新定位，從細胞膜上解離進入細胞核內，與核內轉錄因子相互作用，調節下游靶基因的表達水平，導致細胞黏附力下降，細胞浸潤轉移能力增強，促進EMT的發生。另有研究表明，Hh與Wnt、Notch、Ras、TGF-β及生長因子受體等與EMT發生關系密切的信號轉導通路均存在協同交互作用[5,7]。近年研究發現，Hh信號通路及EMT過程均在腫瘤干細胞的形成及其生物學特性的維持中有著重要作用。Dembinski等[27]發現，CD24+/CD44+，CD133+并表達ALDH的胰腺癌腫瘤干細胞中均有Hh信號通路高表達，而且這類細胞EMT現象較其他胰腺癌腫瘤細胞明顯增強，E-cadherin表達顯著下調，而Twist、N-cadherin、Vimentin及MMP-2的表達均明顯上調。但是在腫瘤干細胞的形成及其生物學特性的維持過程中，Hh信號通路及EMT是否存在相互作用及其作用機制仍有待進一步研究證實。

總之，Hh信號通路可通過介導其下游轉錄因子Snail的表達、下調E-cadherin的表達來直接介導胰腺癌細胞EMT的發生；也可能通過與Wnt/β-catenin等信號轉導通路的交互作用間接介導EMT的發生；抑制Hh信號轉導通路可明顯抑制胰腺癌細胞EMT的發生，進而使腫瘤的侵襲和轉移能力減弱。進一步深入研究Hh信號通路調控胰腺癌細胞EMT的作用機制，將為腫瘤的治療尋找新的切入點及新的藥物作用靶點提供方向。

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2011-01-04)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.024

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