MK886和Celecoxib抑制胰腺癌SW1990細胞生長及血管生成的實驗研究

周國雄 朱陳 丁曉凌 張海峰 張弘 曹維 強暉 徐正府

·論著·

MK886和Celecoxib抑制胰腺癌SW1990細胞生長及血管生成的實驗研究

周國雄 朱陳 丁曉凌 張海峰 張弘 曹維 強暉 徐正府

目的觀察5-脂氧合酶拮抗劑MK886、環氧化酶2拮抗劑Celecoxib干預SW1990細胞后對細胞增殖及血管內皮生長因子(VEGF)mRNA表達的影響。方法應用不同濃度的MK886、Celecoxib以及兩者聯合處理SW1990細胞，采用膽囊收縮素(CCK-8)法檢測細胞的增殖， RT-PCR法檢測細胞白三烯B4受體1 (BLT1)mRNA、前列腺素2(PGE2) mRNA、VEGF mRNA的表達。結果10 μmol/L MK886或20 mmol/L Celecoxib處理24 h后，SW1990細胞的增殖受到明顯抑制(1.80±0.06比1.65±0.10；2.04±0.03比1.86±0.02，P<0.05)，且隨藥物濃度的增加，細胞的增殖抑制更明顯。兩拮抗劑聯合干預12 h后，SW1990細胞的增殖即受到非常明顯的抑制(1.72±0.05比1.52±0.05，P<0.01)。Celecoxib處理細胞48 h后，細胞BLT1、VEGF mRNA表達與對照組比較無明顯變化，但PGE2 mRNA的表達明顯減少(37.50比71.50，P<0.05)；MK886或MK886+Celecoxib聯合處理細胞后，細胞BLT1、VEGF mRNA表達明顯減少(40.30、22.75比126.50，P<0.05)，而PGE2 mRNA的表達與對照組比較無明顯變化。結論花生四烯酸的兩條代謝途徑均與胰腺癌的發生及增殖有密切關系，同時抑制兩條途徑可顯著抑制胰腺癌細胞的增殖。

胰腺腫瘤； MK886； Celecoxib； 5-脂氧合酶； 環氧化酶-2

研究顯示，花生四烯酸代謝途徑與腫瘤的發生、發展有密切關系。花生四烯酸的代謝有兩條途徑，即環氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)代謝途徑。COX代謝途徑的下游產物是前列腺素2(prostaglandin E2,PGE2)，LOX催化的代謝終產物為白三烯(leukotrienes, LTs)。Celecoxib是COX2拮抗劑，MK886是特異性5-LOX拮抗劑。5-LOX還可影響血管內皮生長因子，促進腫瘤血管生成。本研究應用MK886和Celecoxib干預人胰腺癌細胞株SW1990，觀察其對癌細胞生長及VEGF mRNA表達的影響，探討抑制胰腺癌細胞增殖更有效的途徑。

材料與方法

一、細胞培養

胰腺癌細胞株SW1990購自中國科學院上海生命科學研究所，用含10%新生小牛血清的DMEM培養液常規培養， 3～4 d用胰酶消化，按1∶3傳代。

二、細胞增殖檢測

采用膽囊收縮素(CCK-8)法。取對數生長期細胞，以1×104個細胞(100 μl)接種于96孔板培養過夜。加入終濃度為10、20、40、80、100、200 μmol/L的MK886(Bimol公司)或10、20、40、80、100 μmol/L的Celecoxib(上海信合化工有限公司)或200 μmol/L MK886+80 μmol/L Celecoxib繼續培養6、12、24、48 h。每個劑量組設三個復孔。對照組加含0.01% DMSO培養液。培養后每孔加入CCK-8 10 μl，繼續培養2 h。酶標儀測定各孔450 nm處吸光值(A450)。以不加細胞的空白組A450值調零。

三、BLT1、PGE2、VEGF mRNA檢測

采用RT-PCR法檢測。取不同抑制劑培養48 h組和對照組細胞，抽提總RNA， RT-PCR法檢測BLT1、PGE2、VEGF mRNA。引物設計見表1。PCR反應參數：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃ 45 s、72℃ 55 s，36次循環，最后72℃ 7 min。以目的條帶與β-actin條帶灰度值比值作為mRNA相對表達量。實驗重復3次。

四、統計學處理

表1 PCR引物序列

結 果

一、SW1990細胞增殖的變化

10 μmol/L MK886或20 μmol/L Celecoxib處理24 h后，SW1990細胞的增殖受到明顯抑制(P<0.05)，且隨藥物濃度增加，細胞的增殖抑制更明顯(圖1)。200 μmol/L MK886和80 μmol/L Celecoxib聯合干預12 h后，SW1990細胞的增殖即受到非常明顯的抑制(P<0.01，圖1)。

圖1MK886(a)、Celecoxib(b)和兩者聯合(c)處理后SW1990細胞增殖的變化

二、SW1990細胞BLT1、PGE2、VEGF mRNA表達的變化

胰腺癌SW1990細胞均表達BLT1、PGE2、VEGF mRNA。100μmol/L Celecoxib處理細胞48 h后，細胞BLT1、VEGF mRNA表達與對照組比較無明顯變化，但PGE2 mRNA的表達明顯減少(37.50比71.50，P<0.05)；400 μmol/L MK886或200 μmol/L MK886+80 μmol/L Celecoxib聯合處理細胞后，細胞BLT1、VEGF mRNA表達明顯減少(40.30、22.75比126.50，P<0.05)，而PGE2 mRNA的表達與對照組比較無明顯變化(圖2)。

圖2對照組(1)及Celecoxib(2)、MK886(3)、Celecoxib+MK886(4)處理SW1990細胞后的BLT1、PGE2、VEGF mRNA表達

討 論

Eberhart等[1]首先報道COX2在結腸癌中的高表達。將COX2拮抗劑和其他抗腫瘤藥物聯合應用治療胰腺癌有明顯效果[2]。文獻報道[3-4]，結腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌及胰腺癌等細胞株均高表達5-LOX。在胰腺癌組織中，不僅5- LOX表達增加，5-LOX的下游代謝產物LTB4以及受體的表達同樣增加，特別是在胰島周圍、導管細胞內以及纖維變性組織中，他們推斷LTB4同樣能促進胰腺癌細胞的增殖[5-6]。本結果顯示，MK886及Celecoxib均呈劑量及時間依賴性抑制SW1990細胞的增殖；兩者聯合應用具有協同抑制作用。

BLT1是LTB4的高親和力G-蛋白耦聯受體，正常情況下，僅表達于白細胞，在胸腺和脾臟上少量表達。Tong等[6]報道，LTB4受體拮抗劑LY293111在體內外均阻滯胰腺癌細胞增殖。本結果顯示，5-LOX拮抗劑MK886抑制SW1990細胞BLT1 mRNA的表達，而不影響PGE2 mRNA表達；COX2拮抗劑Celecoxib抑制SW1990細胞PGE2 mRNA表達，而不影響BLT1 mRNA表達，提示當阻斷5-LOX代謝途徑時，COX2途徑無明顯變化。因此5-LOX代謝途徑與胰腺癌的發生、發展關系更為密切。

VEGF是刺激腫瘤血管生長的最主要因子。文獻[7-8]報道，COX2/PGE2系統在腫瘤血管生成中起重要作用。本結果顯示，Celecoxib對VEGF mRNA表達無明顯影響，而MK886、MK886和Celecoxib的聯合干預則抑制VEGF mRNA的表達。

總之，通過阻斷花生四烯酸代謝的兩條途徑均可抑制胰腺癌SW1990細胞的增殖，其中5-LOX代謝途徑可能起主要作用，而同時阻斷兩條途徑能更顯著抑制胰腺癌細胞的增殖，為臨床胰腺癌的治療提供新的思路。

[1] Eberhart CE, Coffey RJ, Radhika A, et al. Up-regulation of cyclooxygenase 2gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas.Gastroenterology, 1994,107: 1183-1188.

[2] Ferrari V, Valcamonico F, Amoroso V, et al.Gemcitabine plus celecoxib (GECO) in advanced pancreatic cancer: a phase Ⅱ trial. Cancer Chemother Pharmacol,2006,57:185-190.

[3] Hong SH, Avis I, Vos MD, et al. Relationship of arachidonic acid metabolizingenzyme expression in epithelial cancer cell lines to the growth effect of selective biochemicalinhibitors. Cancer Res, 1999, 59: 2223-2228.

[4] Ding XZ, Iversen P, Cluck MW, et al. Lipoxygenase inhibitors abolish proliferation of human pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun,1999,261:218-223.

[5] Hennig R, Ding XZ, Tong WG, et al.5-Lipoxygenase and leukotriene B4 receptor areExpressed in human pancreatic cancers but not in pancreatic ducts in normal tissue. Am J Pathol,2002,161:421-428.

[6] Tong WG,Ding XZ,Hennig R,et al.Leukotriene B4 receptor antagonist Ly293111 inhibits proliferation and induces apoptosis in human pancreatic cancer cells.Clin Cancer Res,2002,8:3232-3242.

[7] Eibl G, Takata Y, Boros LG, et al.Growth stimulation of COX-2-negative pancreatic cancer by a selective COX-2 Inhibitor, Cancer Res, 2005, 65: 982-990.

[8] Amano H, Hayashi I, Endo H, et al. Host prostaglandinE(2)-EP3 signaling regulates tumor-associatedangiogenesis and tumor growth. J Exp Med,2003,197:221-232.

2011-03-22)

(本文編輯：屠振興)

InhibitoryeffectofMK886andcelecoxibonthegrowthofpancreaticcancercelllineSW1990andangiogenesis

ZHOUGuo-xiong,ZHUChen,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,ZHANGHong,CAOWei,QiIANGHuai,XUZheng-fu.

DepartmentofGastroeterology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the effects of two inhibitors of arachidonic acid metabolic pathway (5-cyclooxygenase blockade MK886 and COX 2 blockade celecoxib) on growth and VEGF mRNA expression of human pancreatic cancer cell SW1990.MethodsPancreatic cancer cells SW1990 were cultured with different concentrations of MK886, celecoxib, MK886 and celecoxib, then the cell proliferation was detected by using CCK-8, BLT1 mRNA, PGE2 mRNA and VEGF mRNA expressions were determined by RT-PCR.ResultsAfter 10 μmol/L MK886 or 20 mmol/L celecoxib treatment for 24 h, the growth of SW1990 was greatly suppressed (1.80±0.06vs1.65±0.10, 2.04±0.03vs1.86±0.02,P<0.01), and the growth suppression of SW1990 cells was increased accompanying the raised concentration of MK886 or celecoxib. After both MK886 and celecoxib treatment for 12 h, the growth of SW 1990 cells was much obviously suppressed (1.72±0.05vs1.52±0.05,P<0.01).After celecoxib treatment for 48 h, the BLT1 mRNA, PGE2 mRNA and VEGFmRNA expressions were not significantly changed, but the expressions of PGE2 mRNA were significantly decreased (P<0.05). After MK886 or MK886+celecoxib treatment, the expressions of BLT1 mRNA, VEGF mRNA were significantly decreased (P<0.05), but the expressions of PGE2 mRNA were not significantly changed when compared to control group.ConclusionsTwo metabolic pathways of arachidonic acid have a close relation with occurrence and proliferation of pancreatic cancer, when both of the pathways were blocked, the proliferation of the pancreatic cancer cell was suppressed obviously.

Pancreatic neoplasms; MK886; Celecoxib； 5-Lipoxygenase; Cyclooxygenase

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.009

江蘇省自然科學基金(BK2004049)，江蘇省重點醫學人才基金(RC2007085)

226001 江蘇南通，南通大學附屬醫院消化內科

周國雄，Email：zhouguoxiong@ medmail．com．cn