胰腺癌內皮分化基因受體表達

龔涌靈 王衛(wèi)東 王少開 陶晨潔 楊勁松 田韌 陳錦飛 王書奎 呂廣梅

·論著·

胰腺癌內皮分化基因受體表達

龔涌靈 王衛(wèi)東 王少開 陶晨潔 楊勁松 田韌 陳錦飛 王書奎 呂廣梅

目的觀察胰腺癌組織溶血磷脂酸(LPA)內皮分化基因受體(Edg/LPA)的表達，探討其臨床意義。方法收集50例胰腺癌及對應癌旁正常胰腺組織標本，采用實時定量PCR、免疫組化和蛋白質印跡法檢測3種Edg/LPA受體亞型Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2和Edg-7/LPA3受體mRNA及蛋白的表達，分析其與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關系。結果胰腺癌組織Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受體mRNA表達量分別為(0.142±0.042)%、(0.471±0.064)%、(0.231±0.043)%，對應癌旁正常胰腺組織分別為(0.132±0.029)%、(0.027±0.015)%、(0.163±0.046)%，其中胰腺癌組織的Edg-4/LPA2受體mRNA表達較對應癌旁組織顯著增加(P<0.05)。同樣，胰腺癌組織Edg-4/LPA2蛋白表達也顯著高于癌旁正常胰腺組織。胰腺癌組織的3種Edg/LPA受體mRNA表達水平與血清CA19-9濃度呈平行關系，差異無統(tǒng)計學意義。胰腺癌組織Edg-4/LPA2受體mRNA表達與腫瘤大小、導管腺癌的分化程度及侵襲轉移有關，而Edg-2/LPA1、Edg-7/LPA3受體mRNA表達僅與腫瘤的侵襲轉移有關。結論胰腺癌組織高表達Edg-4/LPA2受體，其高表達反映出腫瘤的惡性生物學行為。

胰腺腫瘤； 溶血磷脂酸； Edg/LPA受體

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一種對多種細胞具有不同生物學活性作用的磷脂介質，在組織中廣泛存在。它已被證明能夠調節(jié)腫瘤細胞的生長和侵襲[1]。LPA在人胰腺導管腺癌可誘導產生包括細胞增殖、遷徙等生物學效應[2]。LPA通過細胞表面的一類G蛋白耦聯(lián)的七螺旋受體亞族作用于靶細胞,該受體又名為內皮分化基因(endothelial differentiation gene，Edg)或溶血磷脂 (lysophospholipid)受體亞族。常見的Edg/LPA有Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2和Edg-7/LPA3。近年來，LPA受體在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用成為研究的熱點。本研究檢測胰腺癌組織LPA基因受體表達的變化，分析其與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關系，探討其診斷和治療胰腺癌的臨床價值。

材料和方法

一、臨床資料

收集南京醫(yī)科大學附屬南京第一醫(yī)院和深圳市第二人民醫(yī)院2006年6月至2010年10月診治的胰腺癌患者50例，其中男性34例，女性16例，年齡32～64歲,中位年齡52歲。導管腺癌39例,腺泡細胞癌4例,其他類型7例；腫瘤位于胰頭32例，胰體、尾癌14例，全胰腺4例；Ⅰ期 2例, Ⅱ期 6例,Ⅲ期 27例, Ⅳ期15例。另收集對應胰腺癌旁正常組織作為對照。

二、方法

1．Edg-2/LPA1、Edg-4/ LPA2、Edg-7/LPA3受體mRNA檢測：采用實時定量PCR法檢測。引物應用Primer premier 5軟件設計。Edg-2/LPA1正義引物：5′-GCTGCCATCTCTACTTCCATC-3′，反義引物5′-AAGCGGCGGTTGACATAGATT-3′，擴增片段236 bp；Edg-4/LPA2正義引物5′-GCTCAACCCAACCAAC-3′，反義引物5′-TTATCTCTCCCCACCTTA-3′，擴增片段289 bp；Edg-7/LPA3正義引物5′-GCTTGTGAT-TGTTTTGTGTG-3′，反義引物5′-TGGTCAGGTTGCTATGGA-3′，擴增片段338 bp；內參GAPDH正義引物5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，反義引物5′-AGATGATGACCCTTTTGGCTC-3′，擴增片段352 bp。引物由金思特科技(南京)有限公司合成。由PCR儀自帶軟件獲取目的基因及GAPDH的Δt值，以目的基因表達量除以其管家基因GAPDH表達量表示該基因校正后的相對表達量。依據(jù)美國ABI實時熒光定量PCR儀7500的protocl計算公式為：1/2Δt×100%。每個樣本重復3次，取平均值。

2．Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3蛋白檢測：分別采用常規(guī)免疫組化染色和蛋白質印跡法檢測。兔抗人LPA1、LPA2、LPA3抗體及通用型山羊抗兔IgG抗體-Fab段-HRP多聚體均購自北京博奧森生物技術有限公司(貨號：bs-2880R、bs-2881R、bs-2882R、KGAA57)。免疫組化最后DAB顯色，蘇木精復染。用PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判定標準。蛋白質印跡法最后ECL發(fā)光，X線膠片曝光、顯影。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受體mRNA的表達

胰腺癌組織Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受體mRNA表達量分別為(0.142±0.042)%、(0.471±0.064)%、(0.231±0.043)%，對應癌旁正常胰腺組織分別為(0.132±0.029)%、(0.027±0.015)%、(0.163 ±0.046)%，胰腺癌組織的Edg-4/LPA2受體mRNA表達較對應癌旁組織顯著增加(P<0.05；圖1、2)。

圖1胰腺癌及癌旁組織Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受體mRNA表達

圖2Edg-2/LPA1(a)、Edg-4/LPA2(b)、Edg-7/LPA3(c)受體mRNA檢測曲線和標準線性均值(d)

二、Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3受體蛋白的表達

免疫組化顯示Edg-4/ LPA2蛋白表達于癌細胞的胞質和胞膜，癌組織Edg-4/LPA2蛋白表達較癌旁正常明顯增加(圖3)。

圖3胰腺癌(a)與癌旁胰腺組織(b)Edg-4/LPA2蛋白表達(免疫組化 ×400)

蛋白質印跡法顯示胰腺癌組織Edg-4/LPA2蛋白表達較癌旁組織明顯增強；而Edg-2/LPA1及Edg-7/LPA3蛋白的表達與癌旁組織無明顯差別(圖4)。

圖4胰腺癌組織(T)和癌旁組織(C)Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2、Edg-7/LPA3蛋白的表達

三、胰腺癌Edg/LPA受體mRNA表達與臨床病理參數(shù)的關系

胰腺癌組織3種Edg/LPA受體mRNA表達水平與血清CA19-9濃度呈平行關系，但無顯著差異。

胰腺癌組織Edg-4/LPA2受體mRNA表達與腫瘤大小、導管腺癌的分化程度有關，而Edg-2/LPA1、Edg-7/LPA3受體mRNA表達與它們無關。3種Edg/LPA受體mRNA表達均與腫瘤的浸潤、轉移有關，其中Edg-4/LPA2受體mRNA表達與腫瘤的浸潤、轉移相關性最為顯著(表1)。

表1 胰腺癌組織Edg/LPA受體mRNA表達水平與腫瘤臨床病理參數(shù)的相關性

注：aP<0.05

討 論

LPA是膜來源的脂質小分子、結構最簡單的甘油磷酸酯，其甘油骨架上C-3為磷酸基團、C-2為羥基，從而使LPA具有親水性，合成后被釋放到細胞外起到信號分子的作用；Sn位點通過化學鍵與不同長度的長鏈脂肪酸結合產生生物活性，具有親脂性[3]。除血小板外，某些炎癥細胞、神經細胞、損傷細胞、內皮細胞及腫瘤細胞等受到刺激后均可通過自分泌、旁分泌的形式釋放LPA,產生不同的生物學效應[4]。

LPA的受體亞型主要有Edg-2/LPA1、Edg-4/LPA2和Edg-7/LPA3。文獻報道，某些類型的腫瘤細胞,雖然Edg/LPA受體各亞型都能促進細胞遷移，其中最基本的、最重要的受體亞型是Edg-2/LPA1基因受體。敲除Edg-2/LPA1受體或用Ki16425等藥物抑制Edg-2/LPA1受體，可持續(xù)阻斷LPA所致的腫瘤細胞的趨化反應[5]。下調Edg-2/LPA1受體的表達或活性，能抑制乳腺癌荷瘤裸鼠的骨轉移。Edg-2/LPA1相較于其他類型的Edg/LPA受體亞型有著更廣泛的組織分布。

不同于Edg-2/ LPA1受體,Edg-4/LPA2受體似乎并不是LPA引起細胞遷移效應的主要載體。然而有力的證據(jù)表明,惡性腫瘤 Edg-4/LPA2受體的表達通常是增強的。卵巢癌細胞Edg-4/LPA2受體和(或)Edg-7/LPA3受體mRNAs表達顯著高于正常卵巢上皮細胞。30%的卵巢癌高表達Edg-4/LPA2受體，45%的卵巢癌高表達Edg-7/LPA3受體，或兩者兼而高表達[6]。分化型甲狀腺癌高表達Edg-4/LPA2受體mRNA[7]。57%的浸潤性導管乳腺癌高表達Edg-4/LPA2受體，且更常見于絕經后乳腺癌患者(67%)[8]。胃癌也高表達Edg-4/LPA2受體，其中腸型(67%)胃癌的高表達較浸潤擴散型(32%)胃癌更常見，且與淋巴、靜脈浸潤,淋巴結轉移和腫瘤進展相關[9]。結腸、直腸癌Edg-4/LPA2受體mRNA表達較正常腸黏膜顯著增加,而Edg-2/LPA1表達相對低下。

Edg-7/LPA3受體較少在正常組織表達，也僅見卵巢癌組織和卵巢癌細胞株高表達Edg-7/LPA3受體的報道,在其他類型的惡性腫瘤均未見Edg-7/LPA3受體異常表達。另有報道，Edg-7/LPA3受體缺失可提高Edg-2/LPA1受體介導的腫瘤細胞遷移[10]。

本結果顯示，胰腺癌組織Edg-4/LPA2受體mRNA及蛋白的表達顯著高于癌旁正常胰腺組織，而Edg-2/LPA1和Edg-7/LPA3受體mRNA的表達與癌旁組織無顯著差異(P<0.05)，提示Edg-4/LPA2受體的異常表達參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。進一步的分析提示，胰腺癌Edg-4/LPA2受體表達與血清CA19-9同步升高，有可能聯(lián)合CA19-9檢測可為臨床胰腺癌的診斷提供幫助。此外，Edg-4/LPA2受體表達與腫瘤大小、分化程度、及浸潤轉移相關，表明Edg-4/LPA2受體高表達與腫瘤的惡性生物學行為有關。

[志謝：特別感謝美國弗吉尼亞州立大學(Virginia Commonwealth University,VCU)醫(yī)學院的Frank Fang教授，在我們赴美訪問期間提供的幫助和指導，以及相關實驗材料的惠贈。]

[1] Liu S, Umezu-Goto M, Murph M, et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell, 2009,15: 539-550.

[2] Yamada T, Sato K, Komachi M, et al. Lysophosphatidic acid (LPA) in malignant ascites stimulates motility of human pancreatic cancer cells through LPA1. J Biol Chem, 2004,279:6595-6605.

[3] Moolenaar WH． Lysophosphatidic acid, a multifunctional phospholipid messenger. J Biol Chem, 1995,270:12949-12952.

[4] Goetzl EJ, An S． Diversity of cellular receptors and functions for the lysophospholipid growth factors lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. FASEB J, 1998,12:1589-1598.

[5] Panupinthu N, Lee HY, Mills GB.Lysophosphatidic acid production and action: critical new players in breast cancer initiation and progression.Br J Cancer, 2010,102: 941-946.

[6] Jeong KJ, Park SY, Seo JH, et al. Lysophosphatidic acid receptor 2 and Gi/Src pathway mediate cell motility through cyclooxygenase 2 expression in CAOV-3 ovarian cancer cells.Exp Mol Med, 2008, 40: 607-616.

[7] Schulte KM, Beyer A, K?hrer K, et al. Lysophosphatidic acid, a novel lipid growth factor for human thyroid cells: over-expression of the high-affinity receptor edg4 in differentiated thyroid cancer. Int J Cancer, 2001,92:249-256.

[8] Kitayama J, Shida D, Sako A, et al.Over-expression of lysophosphatidic acid receptor-2 in human invasive ductal carcinoma. Breast Cancer Res, 2004,6:R640-R646.

[9] Shida D, Fang X, Kordula T, et al. Cross-talk between LPA1 and epidermal growth factor receptors mediates up-regulation of sphingosine kinase 1 to promote gastric cancer cell motility and invasion. Cancer Res, 2008, 68:6569-6577.

[10] Shida D, Watanabe T, Aoki J, et al. Aberrant expression of lysophosphatidic acid (LPA) receptors in human colorectal cancer. Lab Invest, 2004,84: 1352-1362.

2011-05-26)

(本文編輯：屠振興)

Expressionofendothelialdifferemtiationgenereceptorsinhumanpancreaticcancer

GONGYong-ling,WANGWei-dong,WANGShao-kai,TaoChen-jie,YANGJing-song,TIANRen,CHENJing-fei,WANGShu-kui,LüGuang-mei.

DepartmentofOncologyandCentralLab,Nanjing1stHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210006,China

LüGuang-mei,Email:lvguangmei@yahoo.com.cn

ObjectiveTo evaluate the expression of endothelial differentiation gene /lysophosphatidic acid (LPA) receptors (Edg/LPA) and its clinical significance in human pancreatic cancer.MethodsFifty cases of pancreatic cancer and adjacent normal tissues were collected, and Real-time PCR, Western blot and immunohistochemistry was used to determine the expression of Edg-2/LPA1, Edg-4/LPA2 and Edg-7/LPA3 receptors mRNA and protein, and its relationship with clinicopathological parameters was analyzed.ResultsThe expressions of Edg-2/LPA1, Edg-4/LPA2, Edg-7/LPA3 receptor mRNA were (0.142±0.042)%, (0.471±0.064)%, (0.231±0.043)% in pancreatic cancer, and the corresponding values were (0.132±0.029)%, (0.027±0.015)%, (0.163±0.046)% in adjacent normal tissues. The expressions of Edg-4/LPA2 receptor mRNA in pancreatic cancer were significantly lower than that in adjacent normal tissues (P<0.05). The expressions of Edg-4/LPA2 receptor protein in pancreatic cancer were significantly lower than that in adjacent normal tissues (P<0.05). The expressions of three types of Edg /LPA receptor mRNA in pancreatic cancer were parallel to serum CA19-9 levels. The expressions of Edg-4/LPA2 receptor mRNA were associated with tumor size, differentiation degree, and invasive ability and metastasis. While the expressions of Edg-2/LPA1, Edg-7/LPA3 receptor mRNA was associated with invasive ability and metastasis only.ConclusionsEdg-4/LPA2 receptor is highly expressed in pancreatic cancer, which suggesting the malignant biological behavior of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Lysophosphatidic acid; Edg/LPA receptor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.005

南京市醫(yī)學重點科技發(fā)展項目(ZKX09007)；江蘇省衛(wèi)生國際交流支撐計劃；江蘇省衛(wèi)生廳科教興衛(wèi)工程醫(yī)學領軍人才與創(chuàng)新團隊專項基金(蘇衛(wèi)科教2011字第15號)

210006 南京，南京醫(yī)科大學附屬南京第一醫(yī)院腫瘤科、中心實驗室(龔涌靈、王少開、陶晨潔、楊勁松、田韌、陳錦飛、王書奎)；深圳第二人民醫(yī)院急診科(王衛(wèi)東)；江蘇建康技術學院醫(yī)護系(呂廣梅)

呂廣梅，Email:lvguangmei@yahoo.com.cn，王書奎，Email:shukwang@163.com