糞便Alu序列的檢測在胰腺癌診斷中的價值

任艷 高軍 王小瑋 劉建強 顧俊駿 金晶 龔燕芳 李兆申

·論著·

糞便Alu序列的檢測在胰腺癌診斷中的價值

任艷 高軍 王小瑋 劉建強 顧俊駿 金晶 龔燕芳 李兆申

目的檢測胰腺癌患者糞便Alu序列表達量，探討其對胰腺癌的診斷價值。方法收集41例胰腺癌、27例慢性胰腺炎及23例健康者的糞便樣本，采用酚-氯仿方法抽提糞便中基因組DNA，應用實時定量PCR方法檢測Alu重復序列的表達量。結果胰腺癌、慢性胰腺炎、正常健康者糞便Alu重復序列表達量分別為(5.17±0.99)、(3.79±0.94)、(0.28±0.35)ng/g，三組間差異有統計學意義(P值均<0.05)。通過接受者操作特征(ROC)曲線分析，胰腺癌的曲線下面積為74.8%，95%可信度為0.661～0.835，診斷胰腺癌的敏感性為75.6%，特異性為67.1%。結論胰腺癌患者糞便Alu序列表達量顯著增加，對胰腺癌的診斷可能有一定價值。

胰腺腫瘤； Alu序列； 診斷； 實時定量PCR； 糞便

Alu重復序列是人類基因組中一族散布的、長度大約為300 bp的中等重復序列。它是短分散重復序列(short interspersed elements，SINEs，≤500 bp)中最大的一個家族，約占基因組的5%～10%，以平均間隔4 kb隨機分散于整個基因組中。Alu序列插入到功能重要的基因區或其他Alu依賴性的基因功能改變區會導致多種遺傳性疾病，并且可能和腫瘤的發生相關[1]。本研究旨在觀察Alu序列表達與胰腺癌發生、發展的關系，探討其臨床意義。

材料與方法

一、研究對象

選取長海醫院2007年9月至2010年5月住院患者68例，其中胰腺癌患者41例，慢性胰腺炎患者27例。以正常健康者23例作為對照。患者的一般情況見表1。

表1 各組的一般臨床資料

二、糞便收集方法及DNA提取

標本收集于凍存管后即置于冰盒中，在6 h內轉移至-80℃冰箱保存。從凍存管中稱取200 mg糞便，先加入淀粉及TEN預處理，采用酚-氯仿方法抽提DNA，再采用qiagen純化試劑盒純化DNA。使用NanoDrop (ND-1000, USA) 進行DNA濃度檢測和純度鑒定，置-80℃保存。

三、實時PCR

Alu序列包括保守區域及可變區域，設計的PCR引物應完全或部分位于保守區域(至少是3′端引物，圖1)。Alu上游引物：5′-ACGCCTGTAATCCCAGCACTT-3′；下游引物：5′-TCGCCCAGGCTGGAGTGCA-3′,擴增片段245 bp。糞便DNA以1∶5的比例稀釋，取1 μl加入包含SYBR GREEN Supermix的25 μl反應體系。PCR反應條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s，25個循環。選取30例正常糞便DNA進行混合，作為參照。

陽性標本的PCR擴增曲線呈典型的S型曲線，陰性對照是一條不規則的波浪線。Ct為循環閾值，△Ct=Ct樣品- Ct內參，△△Ct=△Ct-(Ct陰性樣品-Ct陰性內參)，樣品中目的基因初始cDNA相對表達量以2-△△Ct表示。

圖1 PCR引物設計圖

四、統計學處理

結 果

一、RT-PCR標準曲線

制作標準曲線時DNA樣本以10倍體積倍比稀釋，DNA量分別為2.5 ng，250 pg，25 pg，2.5 pg，250 fg，25 fg。標準曲線樣品的PCR擴增曲線見圖2a，標準曲線見圖2b。

圖2 標準樣品的PCR擴增曲線(a)及標準曲線(b)

二、糞便Alu序列的表達

糞便Alu的擴增曲線及溶解曲線見圖3。溶解曲線只有單峰，可排除非特異性擴增。胰腺癌患者Alu序列表達量為(5.17±0.99)ng/g,慢性胰腺炎、正常對照者的表達量分別為(3.79±0.94)、(0.28±0.35)ng/g，3組間差異有統計學意義(P值均<0.05)。通過接受者操作特征(ROC)曲線分析，胰腺癌、慢性胰腺炎和正常對照人群之間有顯著差異，胰腺癌的曲線下面積(AUC)為74.8%，95%可信度為0.661～0.835，診斷胰腺癌的敏感性為75.6%，特異性為67.1%。

圖3 糞便樣品的PCR擴增曲線(a)及溶解曲線(b)

Alu序列在人類基因組中普遍存在，但未見于其他非靈長類物種[2]。目前的研究表明，Alu序列與某些惡性腫瘤的發生密切相關。Rohlfs等[3]用Southern雜交等方法對兩個乳腺癌及卵巢癌家族進行研究，結果顯示Alu介導的同源重組可導致BRCAl基因外顯子8、9間出現5 kb的缺失，認為這種缺失和復制是導致家族性乳腺癌和卵巢癌的重要因素。Tournier等[4]報道，Alu介導的同源重組可導致BRCA2基因外顯子8與外顯子9的缺失。Ichimura等[5]采用相同的方法對神經膠質瘤進行研究，結果顯示Alu介導的同源重組可導致神經膠質瘤特異性基因p107的缺失。Wang等[6]檢測108例遺傳性非息肉性結直腸癌(HNPCC)的MLHl、MSH2、MSH6等錯配修復基因的突變，結果顯示38%的患者存在MLHl和MSH2的點突變，19例患者出現基因缺失，其中42%發生在MLHl，58%發生在MSH2，而這些基因突變都是由Alu介導的同源重組所導致的。Hsieh等[7]在Hep3B肝癌細胞株中分離出了一個異常的CAD基因轉錄產物，它的外顯子3被截短的轉座Alu序列所代替，從而認為肝癌的發生與Alu介導的基因突變有關。Strout等[8]報道，急性髓樣白血病(AML)的發生與染色體導致的基因融合有關，而部分串聯重復又是其中重要的機制，通過對9例AML患者的基因融合的DNA序列進行檢測，發現部分串聯重復總是由Alu介導的同源重組產生。

然而，最近的兩個多中心的實驗研究表明，有關糞便Alu表達的研究非常少，源于糞便標本的收集及儲存可能導致樣本降解，并且抽提方法仍不成熟。本研究采用qiagen試劑盒提供的抽提方法并予以改良，結果表明DNA抽提結果穩定。這一無創性檢查方法具有標本易采取、操作簡便易行等優點，為下一步實驗提供基礎。我們采用實時定量PCR方法的檢測范圍從250 fg到2.5 ng范圍。本結果顯示，胰腺癌患者糞便中Alu序列表達量顯著高于慢性胰腺炎及正常對照者，提示檢測胰腺癌Alu序列的表達量對胰腺癌的診斷可能有一定的價值。

[1] Schmid CW. Alu: structure, origin, evolution, significance and function of one-tenth of human DNA. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1996,53:283-319.

[2] Shih C,Weinberg RA. Isolation of a transforming sequence from a human bladder carcinoma cell line. Cell, 1982,29:161-169.

[3] Rohlfs EM,Puget N,Graham ML,et al. An Alu-mediated 7.1 kb deletion of BRCA1 exons 8 and 9 in breast and ovarian cancer families that results in alternative splicing of exon 10. Genes Chromosomes Cancer, 2000,28:300-307.

[4] Tournier I, Paillerets BB,Sobol H,et al.Significant contribution of germline BRCA2 rearrangements in male breast cancer families. Cancer Res,2004,64:8143-8147.

[5] Ichimura K, Hanafusa H,Takimoto H,et al.Structure of the human retinoblastoma-related p107 gene and its intragenic deletion in a B-cell lymphoma cell line. Gene,2000,251:37-43.

[6] Wang Y,Friedl W,Lamberti C, et al.Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: frequent occurrence of large genomic deletions in MSH2 and MLH1 genes. Int J Cancer,2003,103:636-641.

[7] Hsieh SY,Liaw SF,Lee SN, et al.Aberrant caspase-activated DNase (CAD) transcripts in human hepatoma cells. Br J Cancer, 2003,88:210-216.

[8] Strout MP,Marcucci G,Bloomfield CD,et al.The partial tandem duplication of ALL1 (MLL) is consistently generated by Alu-mediated homologous recombination in acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:2390-2395.

2011-01-14)

(本文編輯：屠振興)

ValueofdetectionoffecalAlurepetitivesequencesinthediagnosisofpancreaticcancer

RENYan,GAOJun,WANGXiao-wei,LIUJian-qiang,GUJun-jun,JINJing,GONGYan-fang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:lizhaoshen111@gmail.com

ObjectiveTo detect the Alu expression in the stool of patients with pancreatic cancer and investigate its value in the diagnosis of pancreatic cancer.MethodsStool samples were obtained from patients with pancreatic cancer (PC) (n=41), chronic pancreatitis (CP) (n=27) and healthy subjects (n=23), the DNA was extracted from the stool and the expression of Alu repetitive sequences was subjected to quantitative analysis by the real-time PCR.ResultsThe expressions of Alu repetitive sequences in PC, CP, and healthy subjects were (5.17±0.99), (3.79±0.94), (0.28±0.35) ng/g, and the difference among the three groups was statistically significant (P<0.05). The AUC of PC was 74.8% with the 95%CI0.661～0.835, and the sensitivity, specificity was 75.6% and 67.1%, respectively.ConclusionsAlu repetitive sequences are highly expressed in the stool of patients with pancreatic cancer, and it is of value in the diagnosis of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Alu repeats; Diagnosis; Real-time PCR; Feces

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.001

國家科技支撐計劃(2006BAI02A12)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申，Email：lizhaoshen111@gmail.com