肝癌干細胞的分子標記與靶向治療

陳怡，邵榮光

腫瘤干細胞假說認為只有很小一部分細胞具有引起腫瘤發生、維持腫瘤生長、保持腫瘤異質性的能力，這樣的細胞叫腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）。腫瘤干細胞假說認為腫瘤組織與正常組織一樣，是由處于各種分化等級的細胞組成的。其中，有一種在數量上占少數的干細胞樣細胞，它具有無限的增殖能力和分化潛能，是腫瘤形成的起始細胞。它在腫瘤的發生、惡化、轉移、復發中起重要作用。目前已經成功的在白血病、腦膠質瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、結腸癌、鼻咽癌等實體腫瘤中鑒定分離到腫瘤干細胞的存在[1-5]。本文就近幾年肝癌干細胞的表面分子標記、分離及成瘤性，以及針對肝癌干細胞的靶向治療進行了綜述。

1 肝癌干細胞的表面分子標記

目前，運用細胞表面分子標記分選的方法獲到 CSC 得到廣泛的應用，而這些表面分子標記是某些 CSC 的特征標記之一，但它又在正常干細胞甚至上皮細胞廣泛表達，所以尋找更好的分子標記成為當務之急。

1.1 CD133

CD133 為5 次跨膜糖蛋白，CD133 蛋白在神經干細胞、表皮干細胞、內皮祖細胞等多種干/祖細胞中都有表達。近年的研究發現，CD133 在白血病干細胞以及腦腫瘤干細胞、大腸癌干細胞、前列腺癌干細胞等多種實體腫瘤干細胞中均有表達[6-7]。Suetsugu 等[8]用 CD133 鑒定肝癌干細胞，體外實驗發現相對 CD133– 細胞，CD133+ 細胞有著更高的增殖潛能，且成熟肝細胞標志物 mRNA 的水平較低，而肝癌早期標志物 AFP 的 mRNA 水平明顯高于對照組。Ma等[9]用多種已確定的干細胞特異標記物來分選純化肝癌組織，最終鑒定和分選出了一小部分 CD133 陽性表達的具有干細胞特性的肝癌細胞，CD133+ 細胞具有更強的克隆形成能力、增殖能力和成瘤性。這群細胞具有與前體細胞相似的特性，包括表達干性基因，自我更新能力和非肝細胞系分化的能力。在此基礎上，Ma 等[10]運用雙向電泳，比較了CD133+ 和 CD133– 亞型蛋白表達，發現 ALDH 與CD133 的表達成正相關，發現 CD133+ALDH+ 細胞具有更顯著的成瘤性。Yin 等[11]發現 CD133+ 細胞存在于人肝癌細胞株和原位肝癌組織中，CD133+ 細胞具有更強的成瘤性和克隆形成能力。Yoshikawa 等[12]發現在肝癌細胞和膽管癌細胞中都有 CD133 的表達，分離出來的 CD133+ 和CD133– 在連續培養中能同樣產生 CD133+ 和 CD133–細胞。

1.2 EpCAM

EpCAM 是高致瘤性腫瘤細胞的一個標記。Yamashita等[13]發現在肝癌活檢標本中，EpCAM+ AFP+ 亞型細胞在基因表達和信號通路分析中具有肝癌干細胞/前體細胞的特性。而從肝癌細胞中分離的 EpCAM+ 細胞具有腫瘤干細胞特性，具有自我更新能力和分化能力，并在體內有更強的侵襲能力。Kimura 等[14]發現肝癌 EpCAM+ 亞群具有更強的克隆形成率，然而細胞增殖沒有差別。體內致瘤實驗，運用了超免疫缺陷 NOD/SCID/γcnull（NOG）鼠，發現最少 100 個EpCAM+ 細胞能形成腫瘤，而 EpCAM- 細胞不能成瘤。不論在體外還是體內，EpCAM+ 細胞能交叉分化出EpCAM+ 和 EpCAM– 細胞，而 EpCAM– 細胞保持其表型。有趣的是，導入外源性的 EpCAM 到兩群細胞中，盡管 EpCAM 表達量一致，卻只能顯著增加 EpCAM+ 克隆的成瘤性，而對 EpCAM– 克隆沒有影響。

1.3 CD90

Yang 等[15]從 6 種肝癌細胞株中分離 CD90+ 和CD90– 的細胞，發現 CD90+ 細胞顯示出成瘤的能力，更容易形成裸鼠肺轉移病灶，而非 CD90– 的細胞。還發現在肝癌腫瘤標本和肝癌患者的血液樣本中，都有較高比例的CD45– CD90+ 細胞。從移植瘤內分離到的 CD90+ 細胞可在免疫缺陷小鼠體內二次成瘤及三次成瘤。

1.4 其他表面標記

Yang 等[16]用肝前體細胞（卵圓細胞）標志 OV6 從肝癌細胞株及原位癌組織中分離出了 OV6+ 細胞，該細胞亞群具有 Wnt/β-catenin 通路內源性活化。OV6+ 細胞與OV6– 細胞比較表現出更強的體內成瘤性和對常規化療的耐藥。周思朗等[17]用二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌，分離培養腫瘤細胞，按照卵圓細胞表面標記（CD34、c2Kit，Thy21、AFP、CK7、CK8、CK14、CK18、CK19 和 GGT）分選腫瘤細胞，結果發現 CD34、Thy21、CK7、CK8、AFP 和 GGT等 6 個標記的陽性與陰性腫瘤細胞移植裸鼠后，成瘤能力差異顯著（P＜0.05 或 0.01）；1/100～1/10 細胞密度的CK7 陰性與 AFP 陽性細胞亞群成瘤能力仍然比其對應細胞亞群為高，CK7（–）和 AFP（+）可能是大鼠肝癌干細胞的部分表面標記特征。

2 肝癌干細胞的分離及成瘤性

目前，CSC 的分離主要通過三種途徑：側群細胞法、表面分子標記以及成球培養。下面介紹近幾年肝癌干細胞分離和成瘤性的研究進展。

2.1 側群細胞

側群細胞（side population，SP）是一群由于具有 ABC膜轉運蛋白而能夠將 DNA 染料 Hoechst 33342 或羅丹明123 外排的細胞，利用流式細胞儀可以將這群細胞檢測出來。眾多實驗提示 SP 細胞可能是干細胞或前體細胞的篩選標志。2006年，Chiba 等[18]首次通過 SP 細胞分選得到肝癌干細胞，發現 SP 細胞與非 SP 細胞相比，具有更強的增殖能力，凋亡細胞較少，表達肝細胞、膽管細胞和胚胎肝細胞標志物，具有更強的腫瘤形成能力。SP 細胞在體內外能通過不對稱分裂產生 SP 細胞和非 SP 細胞，基因芯片結果發現 SP 細胞表達一些干細胞基因，研究表明肝癌 SP細胞具有腫瘤干細胞特性。Kamohara 等[19]分離了 Huh7 細胞中的 SP 細胞，按照細胞周期分離了 G0 期細胞，發現G0 期細胞具有較高的成球性，并在 NOD/SCID 鼠體內有顯著的成瘤性，并且表達肝細胞和膽管細胞分化的標志，表明此細胞亞群具有自我更新、致瘤性和雙向分化的特性。目前，SP 細胞法來進行 CSC 的分選可以成功富集得到CSC，但是因為許多 CSC 具有 ABC 轉運蛋白以外的逃避藥物治療的機制，這種機制不能單靠采用 Hoechst 染料的方法來鑒定；SP 細胞可能遭受染料的毒性作用而喪失了潛在的干細胞特性，SP 細胞不一定包含所有的 CSC。

2.2 運用多個細胞表面分子標記相結合

除了運用單一細胞表面分子標記，近年來很多研究發現，只有運用兩個或者兩個以上的 CSC 細胞表面分子標記才能更好地分離 CSC。研究發現，CD133+ 細胞中CD133+CD44+ 亞型是體內形成腫瘤的主要亞型，而非CD133+CD44– 亞型，這類 CD133和 CD44 雙陽性的細胞更多地表達干細胞相關基因和更加耐藥，這種耐藥與高表達人腺苷三磷酸結合盒轉運體（ABC）蛋白相關[20]。CD90[15]是一個肝癌干細胞的表面分子標記，進一步研究發現，其中CD90+CD44+ 亞群比 CD90+CD44– 亞群細胞更具有侵襲性，可在免疫缺陷小鼠的肝臟原位成瘤并形成肺轉移瘤。

2.3 細胞成球

細胞成球實驗是當前鑒定 CSC 的方法之一，過程是原腫瘤細胞經過消化成單細胞后，在無血清培養基中培養直到形成克隆球（腫瘤球），隨后進一步證實腫瘤球在傳代過程中具有自我更新能力。但腫瘤球仍然是個混合細胞群體，它僅代表一小部分腫瘤起源細胞，有研究表明成球的肝癌細胞有高表達 CD133 肝癌干細胞表面分子標記[21]。目前除了神經球培養條件較為成熟，其他腫瘤干細胞成球培養的條件也是不太一致，限制了這種方法的應用。

3 肝癌腫瘤干細胞的靶向治療

3.1 分子靶向治療

針對 CSC 特異的表面分子標志有望成為一條分子靶向治療的途徑。Yao 等[22]運用 CD133 的反義核苷酸敲除了CD133 的表達，抑制了膠質瘤細胞的增殖，降低了肝癌細胞克隆形成能力，改變了周期分布。這說明 CD133 在這些腫瘤細胞生長過程中起了重要的作用，而 prominin-2，CD133/prominin-1 同源蛋白不具有相同功能。

另外，抑制腫瘤干細胞特異通路將成為治療腫瘤的一條有效途徑。Ma 等[23]證明活化的 Akt/ PKB 和 Bcl-2 通路在 CD133+ 腫瘤細胞耐藥中起主要作用，運用 Akt1 的抑制劑能增加 CD133+ 腫瘤細胞對常規化療藥物 5-FU 的敏感性。肝癌細胞和具有致瘤性肝前體細胞在缺氧情況下細胞活性增加，HIF-1α 和 Akt 上調，形成 PDGF-BB、Akt/HIF-1α/PDGF-BB 通路組成的自分泌信號環路，引起了細胞對順鉑的耐藥。在原位肝癌模型中，加入 HIF-1α 的抑制劑 YC1 后，阻斷了缺血性缺氧時 HIF-1α 的活化，顯著增強了化療的效果，導致了腫瘤生長的抑制，延長了動物的生存期。提示 Akt/HIF-1α/PDGF-BB 環行通路作為靶點，有望成為致瘤性的肝前體細胞及肝癌細胞的治療靶點，更有利于我們從肝癌起源上尋找有效藥物[24]。

肝癌細胞有可能由 STAT3+、NANOG+、OCT3/4+ 的肝前體/干細胞轉化而來，伴隨有 TGF-β 失活，Lin 等[25]在 TGF-β 失活的肝癌細胞中，運用 NSC74859（一種STAT3 的特異抑制劑）能顯著地抑制腫瘤的生長，雖然CD133+ 和 CD133– 細胞均對 NSC74859 敏感，IC50 為100 μmol/L，但該抑制劑能顯著阻滯體內腫瘤的生長，因此，IL6/STAT3 有望成為更好的肝癌治療靶點。

在 Wnt/β-catenin 通路內源性活化的 OV6+ 肝腫瘤干細胞中，運用慢病毒攜帶的穩定表達的 micro-RNA 抑制β-catenin 通路活性，能顯著減少 OV6+ 細胞的數量，并且逆轉 OV6+ 細胞的耐藥[16]。活化 Wnt/β-catenin 通路能增加 EpCAM+ 細胞的數量，而用 RNAi 阻斷 Wnt/β-catenin通路的靶點 EpCAM 后能降低 EpCAM+ 細胞的活性[12]。

You 等[26]發現 TGFβ1 調節肝癌細胞中 CD133 表達具有時間和劑量依賴性。TGFβ1 誘導的 CD133 + Hhu7 細胞后，增加了細胞體內形成腫瘤的能力。運用 Smads 抑制劑，減弱了 TGFβ1 誘導的 CD133+ 的表達。在 CD133–的 Hhu7 細胞中，TGFβ1 的刺激抑制了 DNA 甲基轉移酶的表達，運用 Smads 抑制劑能部分恢復 DNA 甲基轉移酶的活性。提示 TGFβ1 能通過抑制 DNA 甲基轉移酶調節CD133 的表達，TGFβ1 誘導的 CD133+ 的表達依賴Smads 通路。

BMI1 在間充質干細胞自我更新中起著重要作用，肝癌中 SP 細胞比非 SP 細胞優先表達 BMI1，慢病毒敲除BMI1 能持續減少 Huh7 和 PLC/PRF/5 肝癌細胞中的 SP細胞數，更重要的是敲除 BMI1 消除了 SP 細胞體內誘發腫瘤的作用，去除對 BMI1 主要靶基因 INK4A 和 ARF的阻斷，也不能修復 SP 細胞的自我更新能力[27]。

3.2 促分化治療

我們推測 CSC 的分化將最終抑制致癌作用，因為CSC 的致瘤性很大程度上是由其自我更新能力決定的。促分化治療在白血病中取得了很好的效果，那么通過促進CSC 分化在肝癌中的作用尚處于起步階段。肝細胞核因子（HNF）4a 是肝生成中一個必須的中心轉錄因子。運用重組腺病毒基因傳遞系統，將 HNF4a 導入 Hep3B 和HepG2 肝癌細胞，發現 HNF4a 能誘導肝癌細胞分化成肝細胞，能顯著地降低干細胞基因的表達，能減少 CD133+ 和CD90+ 細胞的比例。然而，HNF4a 降低 Hep3B 細胞活性是通過誘導凋亡，而對 HepG2 則是引起周期阻滯和細胞衰老。導入 HNF4a 也能降低肝癌細胞成瘤性[28]。

3.3 抗體治療

單克隆抗體被認為是重要的腫瘤治療的方式。應用CD44 抗體阻斷 CD44 活性，可誘導 CD90+ 細胞體外凋亡，并抑制 CD90+ 細胞在免疫缺陷小鼠體內成瘤。以上實驗結果提示，CD90 是一個較理想的肝癌干細胞候選標志物，而 CD44 是針對 CD90+ 肝癌干細胞的潛在治療靶點[14]。孫力超等[29]分離獲得人原位肝癌組織中 CSC，采用獨特的技術制備了大容量功能性單抗庫，通過對 2964 個雜交瘤克隆的篩選，獲得了 116株能與人肝癌干細胞樣細胞膜結合的陽性單抗。其中有 33株能識別 SP 分選的 CSC，6株還能識別 CD133+ CSC 和含高比例 CSC 的成球細胞。裸鼠體內致瘤性研究發現，其中 4株單抗分選的陽性細胞的致瘤性較單抗陰性細胞高 100 倍，證明了這 4株單抗是抗肝癌 CSC 的單抗。此外，體外功能研究還證明，這些單抗能顯著抑制 SP 分選的 CSC 和成球 CSC 的增殖與成球生長。

除了針對 CSC 本身的抗體靶向治療以外，針對其局部生存環境的靶向治療也有望成為一個有效的靶點。其中VEGF 及其受體作為血管內皮血管床的主要成分參與 CSC小生境的構成，但其在靶向治療 CSC 中的作用有待進一步研究。

4 展望

目前限制肝癌干細胞研究的問題主要集中在以下幾個方面：①表面分子標記的特異性差：目前肝癌干細胞的表面分子標記比較雜亂，不同實驗室、不同的細胞株、不同來源的臨床標本差異性較大，如何結合兩個或兩個以上的標志也值得思考和實驗驗證；②動物模型：目前腫瘤干細胞運用的多為NOD/SCID 小鼠，但有文獻在裸鼠或者免疫更缺陷的NOG 鼠體內驗證腫瘤干細胞的成瘤性。研究發現同一個細胞株，相同的分子標記，在同一個實驗中，NOD/SCID 小鼠中僅需要比裸鼠更少的細胞就能成瘤，如何選擇合適的動物，需要進一步研究。

靶向肝癌干細胞的治療將有望給肝癌的治療帶來新的契機，一方面尋找更特異性的表面分子標志顯得尤為重要，另一個方面單一靶點治療顯得有限，需要從不同的信號通路上尋找多靶點的藥物，針對肝癌干細胞本身和針對肝癌干細胞小生境的治療相結合也將更加有效抑制肝癌的生長和轉移。

[1]Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al.Identification of human brain tumour initiating cells.Nature, 2004, 432(7015):396-401.

[2]Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(7):3983-3988.

[3]O’Brien CA, Pollett A, Gallinger S, et al.A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.Nature,2007, 445(7123):106-110.

[4]Schatton T, Murphy GF, Frank NY, et al.Identification of cells initiating human melanomas.Nature, 2008, 451(7176):345-349.

[5]Visvader JE, Lindeman GJ.Cancer stem cells in solid tumours:accumulating evidence and unresolved questions.Nat Rev Cancer,2008, 8(10):755-768.

[6]Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, et al.Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.Nature, 2007,445(7123):111-115.

[7]Bao S, Wu Q, McLendon RE, et al.Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.Nature, 2006, 444(7120):756-760.

[8]Suetsugu A, Nagaki M, Aoki H, et al.Characterization of CD133+hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells.Biochem Biophys Res Commun, 2006, 351(4):820-824.

[9]Ma S, Chan KW, Hu L, et al.Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells.Gastroenterology, 2007,132(7):2542-2556.

[10]Ma S, Chan KW, Lee TK, et al.Aldehyde dehydrogenase discriminates the CD133 liver cancer stem cell populations.Mol Cancer Res, 2008, 6(7):1146-1153.

[11]Yin S, Li J, Hu C, et al.CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity.Int J Cancer, 2007,120(7):1444-1450.

[12]Yoshikawa S, Zen Y, Fujii T, et al.Characterization of CD133+parenchymal cells in the liver: histology and culture.World J Gastroenterol, 2009, 15(39):4896-4906.

[13]Yamashita T, Ji J, Budhu A, et al.EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor initiating cells with stem/progenitor cell features.Gastroenterology, 2009, 136(3):1012-1024.

[14]Kimura O, Takahashi T, Ishii N, et al.Characterization of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)+ cell population in hepatocellular carcinoma cell lines.Cancer Sci, 2010, 101(10):2145-2155.

[15]Yang ZF, Ngai P, Ho DW, et al.Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer.Hepatology, 2008,47(3):919-928.

[16]Yang W, Yan HX, Chen L, et al.Wnt/beta-catenin signaling contributes to activation of normal and tumorigenic liver progenitor cells.Cancer Res, 2008, 68(11):4287-4295.

[17]Zhou SL, Li P, Zhang JR.Relationship between surface markers characteristic and tumorigenic ability in rat hepatocarcinoma cells.J Fourth Mil Med Univ, 2006, 27(7):587-589.(in Chinese)周思朗, 李鵬, 張積仁.大鼠肝癌細胞表面特標記與成瘤能力有關.第四軍醫大學學報, 2006, 27(7):587-589.

[18]Chiba T, Kita K, Zheng YW, et al.Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.Hepatology, 2006, 44(1):240-251.

[19]Kamohara Y, Haraguchi N, Mimori K, et al.The search for cancer stem cells in hepatocellular carcinoma.Surgery, 2008, 144(2):119-124.

[20]Zhu Z, Hao XF, Yan M, et al.Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+CD44+ population in hepatocellular carcinoma.Int J Cancer, 2010, 126(9):2067-2078.

[21]Zhao X, Ran YL, Yu L, et al.Isolation, cultivation and identification of cancer stem-like cells from human liver cancer tissues.Chin J Cancer Biother, 2009, 16(5):436-441.(in Chinese)趙璇, 冉宇靚, 遇瓏, 等.人肝癌組織中腫瘤干細胞樣細胞的分離培養及鑒定.中國腫瘤生物治療雜志, 2009, 16(5):436-441.

[22]Yao J, Zhang T, Ren J, et al.Effect of CD133/prominin-1 antisense oligodeoxynucleotide on in vitro growth characteristics of Huh-7 human hepatocarcinoma cells and U251 human glioma cells.Oncology Reports, 2009, 22(4):781-787.

[23]Ma S, Lee TK, Zheng BJ, et al.CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway.Oncogene, 2008, 27(12):1749-1758.

[24]Lau CK, Yang ZF, Ho DW, et al.An Akt/hypoxia-inducible factor-1alpha/platelet-derived growth factor-BB autocrine loop mediates hypoxia-induced chemoresistance in liver cancer cells and tumorigenic hepatic progenitor cells.Clin Cancer Res, 2009,15(10):3462-3471.

[25]Lin L, Amin R, Gallicano GI, et al.The STAT3 inhibitor NSC 74859 is effective in hepatocellular cancers with disrupted TGF-beta signaling.Oncogene, 2009, 28(7):961-972.

[26]You H, Ding W, Rountree CB.Epigenetic regulation of cancer stem cell marker CD133 by transforming growth factor-beta.Hepatology,2010, 51(5):1635-1644.

[27]Chiba T, Miyagi S, Saraya A, et al.The polycomb gene product BMI1 contributes to the maintenance of tumor-initiating side population cells in hepatocellular carcinoma.Cancer Res, 2008, 68(19):7742-7749.

[28]Yin C, Lin Y, Zhang X.Differentiation therapy of hepatocellular carcinoma in mice with recombinant adenovirus carrying hepatocyte nuclear factor-4alpha gene.Hepatology, 2008, 48(5):1528-1539.

[29]Sun LC, Zhao X, Yu L, et al.Preparation of functional monoclonal antibodies against human liver cancer stem cells.Chin J Cancer Biother, 2010, 17(2):121-127.(in Chinese)孫力超, 趙璇, 遇瓏, 等.抗肝癌干細胞功能性單克隆抗體的研制.中國腫瘤生物治療雜志, 2010, 17(2):121-127.