丙肝病毒基因組結構及相關功能

張立營，高博

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一種主要經過血液傳播的肝炎病毒，是造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的主要原因之一。目前人們對 HCV 的致病機制的認識仍不很清楚，也缺乏針對 HCV 有效的治療方法及疫苗預防。近年來，通過對 HCV 分子生物學的研究，對其基因組結構以及相關基因表達產物有了近一步的認識。

HCV 屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈 RNA病毒，基因組全長 9.6 kb，含有一個開放的編碼區，可編碼一個多聚蛋白前體，該蛋白前體由宿主和病毒的信號肽酶剪接成 3 個結構蛋白（核心蛋白、E1、E2）和 7 個非結構蛋白（NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[1]。現就 HCV 基因組結構及其編碼的蛋白功能做一綜述。

1 非編碼區

1.1 5′非編碼區（5′UTR ）

5′UTR 包含 HCV 基因組 5′ 端的 341 個核苷酸。它是 HCV 基因組中最保守的區域，存在 3 個高度保守結構區，后兩區與病毒的進化有關，前一區毗鄰病毒蛋白前體翻譯的真實啟動 AUG，對 HCV 基因組的翻譯至關重要。5′UTR 存在內部核糖體的結合位點，核糖體與其結合啟動翻譯過程[2]。

1.2 3′非編碼區（3′UTR）

3′UTR 位于 HCV 3′ 末端，由 22 ～ 55 個核苷酸組成，不編碼蛋白，能穩定病毒生物學性狀，對病毒復制有調節作用。Friebe 等[3]研究發現 3′UTR 包括 1 個基因型特異的多變區（不同基因型之間具有核苷酸序列的差異）、多聚 U 區域（poly U）及 1 段高度保守的 98 個堿基的區域，稱為X-tail。不同基因型的 HCV 的多聚 U 區域有不同的長度。

2 結構蛋白區

2.1 核心蛋白（HCV C）

HCV C 蛋白由 191 個氨基酸殘基組成，是 HCV 基因組中較為保守的結構區域，位于 HCV 基因組 342 ～914 nt 區段。HCV C 蛋白為病毒核衣殼的重要組成部分，與糖蛋白作用組裝出完整的 HCV 病毒顆粒。HCV C 蛋白氨基端富含堿性氨基酸且高度保守，其羧基端具有高度的疏水性[4]。C 蛋白通過與病毒 RNA 的結合來調節 HCV 基因組的翻譯。體外研究顯示，它可通過與宿主蛋白的相互作用調節基因的表達，對原癌基因 c-myc、IL-2、勞氏肉瘤病毒（RSV）LTR、猿猴空泡病毒 SV40 早期啟動子有激活作用，并且 HCV C 蛋白可抑制腫瘤抑制基因 p53 啟動子的活性，與肝癌的發生相關[5-6]。此外，HCV C 蛋白的表達對于IFN-α 誘導的 STAT1 具有顯著的下調作用，HCV 感染所致的慢性肝病過程是 HCV C 蛋白對宿主肝細胞的多層面損傷及對干擾素抵抗等諸多因素作用的結果[7]。

2.2 包膜糖蛋白（envelope glycoproteins）

包膜區基因包括 E1 和 E2 兩部分，分別位于基因組的第 915 ～ 1490 nt 區段（E1）和 1491 ～ 2579 nt 區段（E2），分別編碼相對應的兩種蛋白，構成病毒的外膜[8]。E2區 C端相對保守，N 端變異較大。N 端有兩個高變區，即 HVR1和 HVR2，前者較后者更易變異。通過對 HVR1片段單鏈構象多態分析，發現 HCV 感染者體內同時存在多種序列且有同源性的 HCV 變種，即類似株（準種）。類似株的復雜性、多樣性與病情及肝損傷程度相關，HVR1類似株復雜程度越高，干擾素療效越差。包膜蛋白均為糖蛋白，含有中和性抗原表位，能有效地誘導機體產生保護性抗體，由于該區中的 HVR1易變性，使新的變異株可逃避機體的免疫攻擊，致使 HCV 感染易慢性化，且給疫苗制造帶來困難[9-10]。因此研究包膜蛋白的抗原變異及宿主免疫應答規律，對 HCV疫苗的研究和開發有重要意義。

3 非結構蛋白區（non-structural protein，NS）

3.1 NS1

NS1 基因編碼一段含有 63 個氨基酸的多肽 p7，位于HCV 基因組第 2580 ～ 2768 nt 區段。p7 介于結構蛋白和非結構蛋白之間，有 2 個跨膜結構區。跨膜區通過 α-螺旋結構 2 次跨膜，將 p7 定位于內質網膜上[11]。由于 HCV前體蛋白的加工是在宿主細胞的內膜系統上完成，因而膜定位作用對于非結構蛋白的加工和成熟尤為重要，可能是其加工成熟的前提條件。Cao 等[12]最近的研究顯示，p7 的 CBL（conserved basic loop）是 3 個氨基酸組成的保守環結構，具有離子通道活性，這種活性可被抗病毒藥物金剛烷胺抑制。Griffin 等[13]研究也證實，p7 蛋白在 HepG2 細胞內可以形成六聚體，構成離子通道，說明 p7 屬于病毒細胞外膜孔道蛋白家族（viroporin family），可能對于病毒的成熟和釋放極為重要，同時可以作為抗病毒治療的潛在靶位。

3.2 NS2

NS2 基因編碼由 216 個氨基酸組成的跨膜蛋白 p23，位于 HCV 基因組第 2769 ～ 3419 nt 區段。NS2 蛋白是1 個強疏水性跨膜蛋白，它的 C 末端轉運至 ER 腔中，而氨基端位于細胞腔。NS2 作為 1 個跨膜蛋白，與 HCV 結構蛋白 E1、E2 和非結構蛋白如 NS5A、5B 都存在復雜的蛋白質之間的相互作用。NS2 的主要功能尚不十分清楚，目前已知，NS2 的 C 末端和 NS3 的 N 末端緊密相連，形成一個具有酶活性的復合體，負責 NS2/NS3 位點的切割，其作用方式主要為自身催化[14]。但 Ogata 等[15]研究認為，在某些特定條件下 NS2 蛋白酶可以通過 Trans 方式介導裂解，實驗中觀察到 EDTA 能抑制 NS2/NS3 蛋白酶的活性，而 Zn2+可將之激活，提示它可能為一種金屬蛋白酶（metallo-proteinase)。

3.3 NS3

NS3 基因編碼含有 631 個氨基酸的 p72 蛋白，位于基因組第 3420 ～ 5312 nt 區段，分子量約為 70 kD。它具有多種不同的生化功能，具有 NS2-3 蛋白酶活性、絲氨酸蛋白酶活性、RNA 解旋酶活性和 NTP 酶活性[16]。此外，NS3氨基端 120 個殘基與 HCV 相關腫瘤的發生關系密切。NS3 氨基端可和抑癌基因 p53 形成復合物，阻礙其基因功能，抑制放線菌素 D 誘導的細胞凋亡，并可導致細胞的惡性轉化。Jhaveri 等[17]最近研究認為 NS3 L106A 和 F43A位點突變可抑制絲氨酸蛋白酶活性，并阻礙 NS3-p53 復合物形成，可能成為抑制 HCV 復制及致癌性的新靶位。

3.4 NS4

NS4 基因位于 HCV 基因組第 5313 ～ 6257 nt 區段，其編碼的蛋白被加工處理為兩部分，即 NS4A 和 NS4B。S3 絲氨酸蛋白酶 cis 切割 NS3/NS4A，trans 切割 NS4A/NS4B 和 NS4B/NS5A。NS4A 長 54 個氨基酸，分子量8 kD，N 端為疏水區，C 端為親水區。它具有多種功能，如作為復制復合體的錨定物以及 NS3 絲氨酸蛋白酶的輔助因子，NS4 中央區的疏水性氨基酸是其發揮 NS3 絲氨酸蛋白酶的輔助因子活性功能的重要部位。NS4B 位于基因組5475 ～ 6257 nt 區段，編碼 261 個氨基酸，是一種高度疏水的蛋白，至少 4 個跨膜區，是膜相關定位蛋白[18]。其主要作用包括抑制翻譯，調節 NS5B RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）的活性，引起細胞轉化，誘導細胞非折疊蛋白反應（unfolded proteinresponse,UPR）等。NS4B 主要集中在內質網腔中，可以誘導內質網膜的網狀改變，為病毒復制復合體的形成提供支架[19]。

3.5 NS5

NS5 基因位于 HCV 基因組 6528 ～ 9371 nt 區段，編碼的蛋白被加工處理為兩部分，即 NS5A 和 NS5B 蛋白。NS5A 蛋白位于基因組 6258 ～ 7601 nt 區段，編碼 448 個氨基酸，是高度磷酸化的非結構蛋白。NS5A 分布于細胞核膜周圍的胞漿。它有兩種形式：p56 和 p58。它們都是磷酸化蛋白，只是磷酸化的程度不同[20]。目前發現，它參與了HCV 多種蛋白的成熟和 RNA 復制，并調控宿主細胞多種基因表達，刺激細胞增殖，抑制細胞凋亡以及影響干擾素療效。NS5A 可激活多種轉錄因子如 NF-?β、STAT-3、SRCAP、PCNA 的活性，影響 p53 的功能，抑制內源性和外源性p53 對 p21 啟動子的激活作用，阻礙其介導的細胞凋亡作用。NS5A 還可抑制雙鏈 RNA 依賴蛋白激酶（ds RNA dependent protein kinase，PKR），使細胞增殖失控，最終導致細胞的惡性轉化，并能在裸鼠體內形成腫瘤。NS5A 可影響 IFN-α 的應答，是干擾素治療成功率低的原因之一[21]。目前，關于 NS5A 對 IFN 應答反應的影響已成為研究的熱點。

NS5B 蛋白位于 HCV 基因組 7602 ～ 9371 nt 區段，它的序列高度保守，不僅在 HCV 株之間是保守的，而且在瘟病毒，黃病毒甚至其他 RNA 病毒中也是保守的。Hiscott等[22]研究證實，RNA 依賴的 RNA 聚合酶能在體外催化HCV RNA 產生雙鏈 RNA 發夾樣分子，這表明 NS5B 介導的 RNA 聚合酶通過還原拷貝機制，引發模板的延伸。雖然 NS5B 為病毒復制所必需的，但它并不能單獨完成 HCV的特異復制，必須有病毒和細胞蛋白參與，才能保證病毒自身復制的特異性。研究還表明 NS5B 可能還具有末端核酸轉移酶（TNTase）活性，它能將 UMP 摻入到 RNA 的 3′端，但考慮到不能排除蛋白提純的因素，目前不能完全證實NS5B 具有 TNTase 的活性。熊舒珺等[23]通過實驗證明NS5B 基因可整合到轉染的 HepG-2 細胞的染色體上，并能有效轉錄和表達。體外 RNA 聚合酶試驗和熒光素酶試驗表明穩定表達的 NS5B 在體外和細胞內均具備 RNA 依賴的 RNA 聚合酶活性。

4 展望

綜上所述，HCV 病毒的分子生物學結構的研究已經取得了巨大的進展，HCV 病毒所編碼的蛋白與病毒基因的復制、前體蛋白的加工、病毒的生命周期以及宿主細胞周期都有極為密切的關系。對 HCV 分子生物學研究的不斷深入將為抗 HCV 藥物及針對 HCV 的治療方法提供新的思路。在目前丙型肝炎防治工作處于困境的情況下，對 HCV 各種結構和酶功能的進一步研究也許會給抗 HCV 藥物和疫苗的工作帶來某些意想不到的突破。

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