生物降解微球制劑的體內外相關性研究進展

李靜，蘇慶，趙剛

可生物降解注射用微球是近年來發展較快的一種新劑型，它是指利用天然或合成的高分子材料，將固體或液體藥物包嵌成直徑為1～250 μm 的微小球體。該制劑技術將蛋白和多肽等類藥物制備成以微球為載體的長效緩控釋制劑。通過皮下或肌肉給藥，使藥物在一定時間內緩慢釋放出來，在體內長期維持有效的血藥濃度，顯著減少給藥次數，提高患者的順應性，實現安全、有效、方便給藥。微球制劑的體外釋藥特性主要是研究微球體外釋藥動力學過程；而緩控釋微球在體內所形成的藥物動力學過程是評價微球控釋效果的終極目標。體內外相關性（in vitro—in vivo correlation，IVIVC）是用數學模型描述藥物體外釋放特性（藥物溶出的速率或程度）與體內藥動學過程（血藥濃度或藥物吸收量）的關系。制劑 IVIVC 模型是用已知藥物體外釋放特征，預測藥物體內的藥時曲線。建立 IVIVC 的目的是通過體外實驗，預測藥物在體內的作用特征，可指導和優化處方的設計，確立更具代表性的釋放度測定實驗方法，為質量標準的制訂提供依據；同時還可減免生物等效性研究[1-2]。本文就近年來微球制劑的體外釋放度評價及體內外相關性的研究進展進行綜述。

1 微球制劑的體外釋放度評價

體外釋放度試驗是指微球制劑在特定條件下釋藥速率的體外評價方法。適宜的體外釋放度試驗方法能夠較好地反映微球在體內的釋藥狀況，有利于篩選出更理想的處方及工藝。

1.1 體外釋放度實驗方法

目前藥典上還沒有收載專用于微球體外釋放度測定的方法，研究者一般采用自行設計的方法，使體外釋放條件盡可能地模擬體內。測定溫度一般為37℃，測定介質的體積通常遠小于常規的溶出度測定法，可以只有幾十毫升乃至幾毫升，但必須滿足漏槽狀態[3]。

1.1.1 搖床法 亦稱培養法或提取法，將一定量的微球直接置入一定體積的介質中，在一定頻率下振蕩，定時取樣，在取樣的同時補充相應的新鮮介質或在測試后再將取出的介質放回去[4-5]。該法的主要缺點是取樣過程中很難避免微球的損失。此外，隨著聚合物酸性降解產物的形成和積累，介質的 pH 值可能會持續降低。

Han 等[6]采用 W/O/W 復乳溶劑揮發法制備載平陽霉素 PLGA 微球，搖床法測定釋放度，介質 37℃、25 ml、轉速 75 r/m，10、20、28 d 的累積釋放量分別為45%、80%、100%；以 Beagle 犬為實驗動物，測定體內 10 d 的累積釋放量為60%，而 20 d 的累積釋放量為97%以上，體內釋放速率顯著快于體外。

1.1.2 動態透析法 透析法是將藥物微球放入透析袋，置于相應介質中進行測試。振蕩的頻率可以是 50、75 r/min和 1 周振搖數次等。這是目前應用較多的一種測定方法[7]。該方法有利于透析膜外介質的交換，可避免樣品處理過程中微球的損失和釋放介質 pH 的改變。

1.1.3 藥典的溶出度測定法 包括槳法[8]、轉籃法和流通池法（flow-though cell）。2000 版《美國藥典》（USP）和 1998版《英國藥典》（BP）在控釋制劑釋放度檢查項下均收載流通池法，該方法的實驗條件近似生理狀態，方法簡便、重現性好，比較適合于微球制劑的體外釋放度評價，但該儀器普及率不高，實際研究工作中多采用搖床法或動態透析法。Majithiya 和 Murthy[9]采用《美國藥典》溶出度測試儀的槳法測定了克拉霉素殼聚糖微球在 pH 1.2 的模擬胃液中的釋放度。

1.2 體外加速釋放試驗

藥物從生物降解微球注射劑內釋藥往往需要數天、幾個月甚至 1年以上的時間，采用模擬體內條件按“實時”方法考察藥物的釋藥速率，在生產上顯然是行不通的，所以研究一種有良好相關性的體外釋放加速試驗方法，對快速檢測微球的質量有十分重要的意義[10]。

1.2.1 釋放介質 釋放介質的組成、pH 值、離子強度、滲透壓、表面活性劑種類及濃度、介質溫度及酯酶等對釋放速率都可能有顯著影響。

長效注射微球一般采用肌注或皮下注射，而組織環境的pH 為7 左右，故常采用的介質是 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液。Zolnik 和 Burgess[11]研究了降低介質 pH 對地塞米松微球釋放的影響。結果表明，釋放初期酸性和中性介質區別不大，微球具有相同的突釋量，停滯釋放相也相當。但隨著聚合物的進一步降解，低 pH 條件逐步加快了聚酯微球的釋藥速率。最終，實時釋放需要 30 d 的微球，在酸性介質中 19 d 便可釋放完全。

1.2.2 釋放溫度 冼遠芳等[12]考察了不同載藥量的阿司匹林聚乳酸微球在不同溫度下的體外釋藥行為，采用動態透析法，參考聚乳酸的玻璃化轉變溫度，Tg=（53±1.0）℃，選擇釋放介質磷酸鹽緩沖溶液的溫度分別為42、47、55、58℃，結果表明，一級釋藥方程能比較好地描述阿司匹林聚乳酸微球的釋藥特征。阿司匹林聚乳酸微球在 37℃長期釋放累計百分數（y%）與不同溫度（42，47、55、58℃）下加速釋放的累積釋放百分數（Y%）的相關性，采用ln(100-Y) 對 ln(100-y) 線性擬合，結果表明，兩種不同載藥微球的長期釋放與在 55℃時加速釋放有良好的相關性（RA= 0.99547，RA= 0.99338）。在高于聚乳酸 Tg約 2～3℃的 pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液，進行體外釋放可以作為快速考察聚乳酸微球長期釋放行為的有效方法。

1.2.3 其他因素 Mesens 等[13]建立了利培酮微球體外加速釋放的方法，他們在釋放介質中按質量比加入 27.5%的乙醇，獲得了較好的加速效果。Faisant 等[14]研究了放射吸收量對 5-氟尿嘧啶-PLGA 微球釋藥的影響，結果表明，藥物釋放速度隨著放射性吸收量的增加而加快。

2 微球制劑的體內外釋放相關性評價

按照《中國藥典》（2010 版）二部中“緩控釋制劑指導原則”只有當體內外具有相關性，才能通過體外釋放曲線預測體內的情況。體內外的相關程度的高低與體外釋放度測定方法和體內藥動學測定方法有關，也與結果的數學處理和統計分析方法有關。對微球體內釋藥行為的評價現主要采用兩種方法[15]：①給藥部位微球殘余藥量評價；②血藥濃度測定。

2.1 體內外相關性評價的方法

體內外相關性可分為三級水平：①體外釋放曲線與體內釋放曲線上對應的各個時間點分別相關，即點對點相關，表明兩條曲線可以重合；②應用統計矩分析原理建立體外釋放的平均時間與體內平均滯留時間之間相關；③將一個釋放時間點（t50%，t90%等）與一個藥動學參數（如AUC，Cmax或tmax）之間單點相關。

Zolink 和 Burgess[16]采用流通池法測定載地塞米松PLGA 微球體外釋放度，體外釋放特性呈顯著三相特征即突釋相、時滯相和次零級釋放相（secondary zero-order）。而體內釋放特性與體外釋放有所不同，體內無時滯相，其釋放速率特性呈表觀零級（apparent zero-order）釋放，且釋放速率比體外釋放快，產生這種現象的原因與體內酶的作用、組織間隙液容量及其微球周圍微環境的 pH 有關。將 PLGAMw13000 載地塞米松微球各相應時間點體外累積釋放量對體內累積釋放量作線性回歸，兩者相關性顯著：體內累積釋放量（%）= 1.6381×體外累積釋放量（%）－ 24.457，R =0.9862。實驗證明：該方程可較準確地的描述體內外釋藥行為的相關性。

2.2 體內吸收數據的計算方法

2.2.1 室模型依賴法 點對點相關水平的分析中，體內吸收數據的計算采用依賴室模型的計算方法（如 wangernelson 法、loo-Rigelman 法）。室模型的計算方法簡單，融入了較多的實驗數據，數據的點對點對應能較完整地反映微球中藥物的體外釋放和體內吸收之間的相關關系。王津等[17]對布洛芬緩釋微球的大鼠體內血藥濃度-時間數據進行房室模型擬合，結果顯示用單室開放模型擬合較好，以體外累積釋放度（X）為橫坐標、體內吸收百分率（F）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 F = 1.5481X + 5.1587，r = 0.9887，表明體外釋放度與體內吸收百分率相關性顯著。

2.2.2 逆卷積分法 美國 FDA 選用逆卷積分法計算體內吸收（溶出）數據，該法不需要對體內血藥濃度一時間數據與體外釋放數據進行模型擬合，直接得到體內藥物的吸收動態變化，同時還可以通過體外釋放數據預測體內血藥濃度。逆卷積分法不依賴室模型的擬合，對于模型化困難的藥物尤其適合，適用于各種體內外數據的相關性研究。梅康康等[18]應用逆卷積分法計算非諾貝特緩釋微球片的體內外相關性，結果表明非諾貝特緩釋微球片的體外釋放與體內吸收相關性良好。

2.2.3 統計矩法 采用普通的藥動學參數AUC、Cmax或Tmax作為體內參數與體外釋放數據進行相關性分析，這是一種部分相關，所得的相關參數不能反映血藥濃度-時間曲線形狀。統計矩分析法不受模型的限制，無需假設藥物在系統中的轉運動力學，把藥時曲線看作某種概率統計曲線，運用了所有的體內外數據進行計算，體內參數可采用平均體內藥物滯留時間（MRT）、平均藥物吸收時間（MAT）或平均體內釋藥時間（MDT），體外參數采用體外平均釋放時間（MDT in vitro），通過比較體內外參數建立起較高水平的相關性。Guerrero 等[19]研究聚（D，L-丙交酯）-聚（D，L-乳酸，羥基乙酸）共聚物酮替芬微球的體內外相關性，通過比較體外平均釋放時間和體內藥物滯留時間，建立二級體內外相關性水平。

Monti 等[20]分別采用泊洛沙姆（Poloxamer 407）及其與月桂酸聚乙二醇甘油酯（Gelucire? 50/13）的混合物制備載阿替洛爾經口腔黏膜給藥的微球制劑。用透過醋酸纖維素膜法和 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液進行體外釋放度試驗。釋放時程為480min，Poloxamer 407 及其與 Gelucire? 50/13的混合物制備的微球累積釋放量分別為（25.05±3.86）%和（44.44±4.20）%；以家兔為實驗動物進行生物利用度評價，統計矩分析法計算藥動學參數，其絕對生物利用度分別為29.38%和 33.07%，而等劑量的上市口服制劑為17.42%，口腔黏膜給藥的阿替洛爾微球制劑可顯著提高生物利用度。

3 小結

盡管體內外釋藥速度可以保持較好的相關性，但從已有的研究不難看出，藥物在體內的釋放速率常常快于體外。通過體外釋放度試驗條件的選擇可以獲得良好的體內外相關性。采用透析法以 pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液為介質是目前用的較多的方法。體內各種免疫反應以及降解產物所導致的微酸性環境等因素導致了體內釋放速度快于體外。

注射微球體外釋放度測定周期長，因此，非常有必要建立體外釋放度的加速試驗方法用于快速的篩選處方和工藝參數，經實驗研究可建立起加速試驗方法來快速考察長效生物降解微球的體外釋放度。

采用逆卷積分法計算體內吸收數據，與相應時間點的體外累積釋放百分數作線性回歸，考察制劑的體內外相關性，不受隔室模型擬合的制約，適用范圍廣、準確性好；目前該方法為進行體內外相關性研究的較好方法。

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