系統性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞APO2.7的表達及意義

李 明 朱 蕓 馬晶晶 趙雪麗 (濰坊市人民醫院風濕免疫科，濰坊261041)

越來越多的研究發現系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)淋巴細胞的多克隆活化與淋巴細胞的凋亡紊亂密切相關。在細胞凋亡的調控系統中，線粒體膜蛋白的特異性抗體(APO2.7)是與Fas同族的膜蛋白，是凋亡細胞的一個早期反應。本研究通過測定SLE患者不同時期外周血淋巴細胞APO2.7的表達，探討系統性紅斑狼瘡與淋巴細胞凋亡的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 SLE患者均為2003年6月～2009年3月本院住院病人，所有病例均符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE分類診斷標準，以SLE疾病活動評分(SLEDAI)判斷疾病的活動度，SLEDAI≥8分為活動期，＜8分為非活動期。46例患者中女性38例，男性8例，年齡最大62歲，最小16歲，平均年齡(30.73±10.31)歲，活動期31例，非活動期15例，病程最長96個月，最短3個月。正常對照為門診體檢正常人群20名。經詳細詢問病史及系統查體，排除可疑帶病者。兩組在性別和年齡構成上差異無統計學意義。

1.2 研究方法

1.2.1 特殊試劑 藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人APO2.7(APO2.7-PE);用于免疫陰性對照性的IgG1-PE均為美國Pharmingen生產的產品，由北京岳泰生物公司提供。淋巴細胞分離液由中國醫學科學院血液研究研所生產。

1.2.2 淋巴細胞的制備 取肝素抗凝血2 ml，重層于淋巴細胞分離液上，1 500 r/min，離心15分鐘，提取其中的淋巴細胞層，再用PBS洗脫2次，棄上清液備用。

1.2.3 免疫反應 取2支試管各加待測的淋巴細胞懸液500 μl(細胞數為106ml-1)，其中的一支淋巴細胞懸液管加單抗工作液20 μl，另一支加陰性對照單抗IgG1-PE，避光反應20分鐘，待測。

1.2.4 流式細胞儀(FACScan型，美國BD公司生產)檢測 光源488 nm的氫離子激光，上機前以標準熒光微球調整儀器的變異系數并穩定在2%以內，上機后收集2萬個細胞，熒光強度以對數放大，光散射數據存盤，測試完后在Macintosh 650計算機上用CellQuest Plot軟件程序(美國BD公司提供)分析數據，以標記陽性淋巴細胞百分率表示表達水平。

1.3 統計學處理 實驗數據分析使用SPSS11.0軟件處理，以±s表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，相關性分析采用Spearman分析，以P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 SLE患者外周血APO2.7的測定結果 46例SLE患者外周血APO2.7水平為(25.62±13.24)%，高于20例正常對照組(5.89±1.62)%(P＜0.05)。31例活動期SLE患者外周血APO2.7水平為(58.71±24.41)%，15例穩定期SLE患者外周血APO2.7水平為(12.22±6.44)%，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 外周血APO2.7水平與SLE患者SLEDAI評分、ESR、C3補體水平的相關性分析 46例SLE患者外周血APO2.7水平與ESR、IgG、SLEDAI評分呈正相關(r=0.581、0.577、0.552，P ＜ 0.05) ，與 C3補體水平呈負相關(r=-0.512，P＜0.05)。

3 討論

系統性紅斑狼瘡是一種常見的自身免疫性疾病，主要免疫學特征是淋巴細胞的功能紊亂，已有研究發現，SLE的發生和發展可能與淋巴細胞凋亡有關，SLE患者淋巴細胞在組織培養中，其凋亡率明顯高于正常淋巴細胞[1，2]。細胞凋亡與SLE的關系國內已多有報道，主要集中在Fas介導的凋亡機制研究方面，研究結果并不一致[3，4]。王曉樂等[5]研究發現SLE異常增高的IL-10促使 T細胞高表達FasL，誘導CD4+T細胞凋亡，參與了SLE的病理進程，郝加虎等[6]發現SLE患者的PBMCs早期凋亡率顯著升高，且與患者的疾病活動度和器官/系統損害程度相關。Dieker等[7]的研究顯示細胞凋亡在自身抗體特別是抗核小體生成過程中發揮了重要作用。

線粒體是細胞凋亡的中心環節，APO2.7分子量為38 000，是由Zhang等[8]首先報道的新的細胞凋亡標志，有促進細胞凋亡的作用，主要通過線粒體途徑介導細胞凋亡。APO2.7在凋亡檢測中極具前景，是凋亡細胞的一個早期反應，早于細胞形態學和光學特性的變化。陳宏新等[9]研究提示APO2.7可能不是凋亡測定的特定標志而是在細胞死亡(凋亡和壞死)過程中發揮作用。

目前，國內對 APO2.7的研究不多，張璇等[10]檢測系統性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞APO2.7水平高于對照組。本資料發現SLE患者淋巴細胞APO2.7水平明顯高于正常組，且SLE活動期較非活動期高，而APO2.7表達率的增加導致了對其介導的凋亡的敏感性增加，從而可能引起淋巴細胞的凋亡率增高，提示SLE活動期較非活動期凋亡增加。傳統認為藥物如糖皮質激素、細胞毒藥物可誘導細胞凋亡，本組31例活動期患者均在未接受任何藥物前收集血樣，所以活動期患者凋亡增加，可以認為與藥物無關，而與SLE患者淋巴細胞本身免疫異常有關。淋巴細胞凋亡在SLE發病中的作用十分復雜，彭春林等[11]研究揭示了外界環境和遺傳作用共同啟動的細胞凋亡在SLE發病的作用。大體機制可能為:在特定外界刺激下，SLE患者本身免疫紊亂導致淋巴細胞凋亡增加，淋巴細胞在非正常凋亡過程中暴露產生各種細胞自身抗原片段，誘使多種自身抗體生成，如抗核小體抗體，從而加重自身免疫反應，免疫狀態的混亂會啟動新的細胞凋亡、炎癥的加重等多種病理過程。淋巴細胞APO2.7水平與SLE疾病活動指數SLEDAI、ESR、IgG正相關，表明凋亡越明顯，病情越重，提示APO2.7與SLE的病情活動密切相關:凋亡早期APO2.7陽性表達率較顯著，可以預測早期細胞凋亡損傷的程度和估價預后。

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2 Kalden J R.Defective phagocytosis of apoptotic cells:possible explanation for the induction of autoantibodies in SLE[J].Lupus，1997;6(3):326-327.

3 王曉非，蔣 莉，趙麗娟 et al.甲基強的松龍和環磷酰胺誘導系統性紅斑狼瘡患者血中淋巴細胞凋亡的研究[J].中華風濕病學雜志，1999;3(4):241-243.

4 邱明山，阮詩瑋，王 智 et al.狼瘡腎炎患者外周血淋巴細胞凋亡調控因子和血清尿白細胞介素-8的變化[J].中華風濕病學雜志，2004;8(1)1:20-22.

5 王曉樂，吳秀梅，陳 斌et al.系統性紅斑狼瘡患者血清IL-10與T細胞凋亡的關系研究[J].南京醫科大學學報(自然科學版)，2007;10(11):1118-1122.

6 郝加虎，張志華，張國慶 et al.外周血單個核細胞早期凋亡與SLE患者器官/系統損害的關聯研究[J].中國衛生檢驗雜志，2008;18(6):1025-1029.

7 Dieker J，Muller S.Post-translational modifications，subcellular relocation and release in apoptotic microparticles:apoptosis turns nuclear proteins into autoantigens[J].Clin Immunol，2009;132(3):349-361.

8 Zhang C H，AO Z，Schlossman S F et al.A mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptotic cells[J].J Immunol，1996;157:3980-3987.

9 陳宏新，沈立松，沈 霞.APO2.7在凋亡和壞死的HL-60細胞中的表達[J].上海第二醫科大學學報，2001;21(3):206-209.

10 張 璇，呂維紅，安志潔.Apo2.7抗體標記原位法在SLE患者外周血淋巴細胞凋亡檢測中的應用[J].齊魯醫學檢驗，2003;14(4):7-9.

11 彭春林，江 峰，王寶濤et al.程序性細胞凋亡1基因單倍型及紫外線暴露與系統性紅斑狼瘡的相關性研究[J].中華醫學遺傳學雜志，2010;27(4):417-422.