上皮-間質轉化及相關microRNA分子與腫瘤的惡性行為的研究進展

洪倫 綜述 沈守榮 審校

1.長沙市第八醫院消化內科，湖南 長沙，410100 2.中南大學湘雅三醫院消化內科，湖南 長沙， 410013

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在胚胎形成和傷口愈合等方面起著關鍵的作用。目前研究發現其與腫瘤的發生、發展有關，癌細胞發生EMT后能獲得更強侵襲和轉移能力，此外還對腫瘤細胞的耐藥性產生影響。以RNA(microRNA，MCR)是新發現的一類非編碼小RNA，具有基因轉錄后調控的作用，在很多生理病理過程中均起著重要作用，包括腫瘤、發生、進展，并與腫瘤EMT有關。

1 EMT現象與腫瘤

EMT，即上皮樣細胞向間質樣細胞表型特征的轉化。此概念是上世紀70年代使用雞胚研究其形成和發育的過程中所提出的一個假設。而首次描述觀察到的EMT現象，則是人們發現人類眼的晶狀體細胞能在類凝膠膠質中相對失去極性，轉化成間質細胞樣形態后同時獲得移動能力。往后數年研究中，陸續發現EMT在胚層轉化、原胚腸形成及神經嵴細胞遷移等胚胎形成發育領域起重要作用［1］。近年研究又在傷口愈合，組織再生［2］，干細胞分化［3］及肝、腎等器官組織的纖維化病變中也陸續發現EMT，是一種重要的病理生理現象［4］。越來越多的研究發現EMT在多種腫瘤的侵襲及轉移等惡性發展過程中起著重要的作用［5-6］。

1.1 腫瘤EMT中的細胞表型變化

可以從上皮細胞與間質細胞各自的特點觀察EMT現象發生后的特征變化。上皮細胞是一種有黏聚性的細胞，主要組成上皮組織，覆蓋著人機體表面和多個器官管腔內表面。鱗癌、腺癌、移行上皮癌等上皮來源的惡性腫瘤歸屬此范疇。上皮細胞的特征是細胞與細胞之間有著相對緊密的連接，并且與其所附著基底膜之間有著很強的極性，即相對穩定和不可移動性。而間質細胞是間質及結締組織的主要組成成分，間質細胞的特征在于結構松散，細胞相對沒有極性，有著相對高的可移動性，分散存在于細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)中。這兩類細胞結構上的差異同樣反映在各自特性的基因和蛋白表達上。

EMT是上皮特征性的細胞發生一定程度的轉變，使得其具有部分間質樣細胞特征的現象，結合以上描述的此兩類細胞的特征后可得出腫瘤細胞EMT現象的實質：具有上皮來源特征性的腫瘤細胞，通過EMT獲得間質細胞樣的高遷移運動、侵襲浸潤能力。EMT過程中，細胞的形態學變化和特征性分子標志可作為判斷其發生程度的標準。

1.1.1 形態學變化特征

第一屆關于EMT的Boden國際會議提出：在細胞形態學和侵襲運動方面，以4個標準來判斷細胞發生了EMT現象：⑴細胞極性的喪失；⑵出現紡錘形樣等成纖維樣的細胞形態(紡錘形樣)；⑶可出現板狀/絲狀偽足(fp)；⑷侵襲運動性增強。

1.1.2 分子標志物變化特征

EMT是一個動態的、多步驟且調節機制復雜的過程。包括細胞之間黏附的喪失，細胞與周圍腫瘤過程中所附著基底膜和ECM的破壞以及細胞骨架的重建而導致細胞遷移力和運動能力的增強這幾大基本特征。因而下調上皮細胞黏附相關分子、上調間質細胞特征相關分子及表達各種ECM相關的蛋白是EMT的分子變化特征。

1.1.2.1 下調上皮細胞黏附連接相關分子

E-黏附蛋白(E-cadherin)表達降低或丟失是EMT 最重要的標志性變化。E-黏附蛋白屬于1型鈣黏蛋白(CDH1)，結構域橫跨細胞膜。細胞外部分使得相鄰的細胞之間緊密相互結合；細胞內部分則與α-聯蛋白(α-catenin)、β-聯蛋白(β-catenin)以及肌動蛋白(α-SMA)形成數種復合物，從而組成細胞之間的連接黏附，使得細胞與細胞間有著強大的物理性連接，是維持上皮細胞特性的重要分子， 其丟失的細胞則出現間質細胞樣的極性丟失。E-黏附蛋白水平下調以后，此時與之結合的β-聯蛋白游離出來，轉位到胞核內，與轉錄因子淋巴增強結合因子(lymphoid enhancer binding factor，LEF)結合形成β-黏附蛋白/LEF復合體，調控的轉錄。

1.1.2.2 上調間質細胞來源相關分子

間質細胞特征的功能分子，主要是一些間質或胚胎來源的骨架蛋白，在一般上皮細胞不表達或表達非常低下。而發生EMT現象后，這些分子重新表達或高水平表達亦是其標志性變化。

N-鈣黏蛋白(N-cadherin)是間質細胞來源的骨架蛋白之一，在正常上皮細胞中基本無表達或很少有表達。其主要功能是介導成纖維細胞的動態黏附，有助于這些間質細胞的移動。N-鈣黏蛋白在前列腺癌、乳腺癌和胃癌等多種惡性腫瘤中存在反常高表達。另外，波形蛋白也是細胞骨架蛋白之一，特異性的也分布于間質細胞中，在上皮細胞中基本不表達。波形蛋白表達異常增多導致細胞骨架蛋白構成發生變化，使得上皮源性細胞具有成纖維細胞樣特征，更易于遷移游動。波形蛋白在腫瘤中表達上調不僅與腫瘤分級相關，還可促進腫瘤的轉移。

1.1.2.3 ECM相關分子

在PCB設計時，需要使用接地器件實現“0”參考點。用于射頻接地的器件有3種，分別是“0”電容、微帶線和射頻電纜。射頻模塊采用“0”電容接地；通過“0”電容與“無窮大”電感相互配合，盡可能降低電路干擾[32]。

ECM主要包括膠原層黏連蛋白等，功能為促進成纖維細胞及角膜上皮細胞的遷移，特別是層黏連蛋白可促進多種腫瘤細胞的遷移。研究發現：ECM成分不僅促使腫瘤細胞發生EMT，而且發生了EMT 的細胞也能夠改變ECM的組成，便于腫瘤浸潤和轉移。

1.2 腫瘤EMT相關信號通路及轉錄因子

EMT受各種因素調控，在誘導EMT形成的模型中，信號分子與細胞膜表面特異性的受體結合，進而通過細胞內各條不同的信號轉導途徑活化， 激活核內的轉錄因子，從而使細胞表型發生不同程度的轉化。故細胞信號轉導途徑和轉錄因子的激活等與EMT的發生有著密切的關系。

EMT現象涉及多條信號通路，其中轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)信號傳導通路是研究較成熟的EMT通路。多年的研究結果提示：血清TGFβ1水平不僅與腫瘤惡性程度呈正相關，而且也是有效的EMT誘發因素。核轉錄因子kappaB (nuclear factor kappaB，NF-κB)是 TGF通路誘導EMT發生的重要分子，同樣可以促進Snail轉錄因子的表達，從而下調E-黏附蛋白的表達水平。

Wnt通路也是EMT中1條重要的信號通路，β-連蛋白是Wnt信號通路中的關鍵蛋白，其通過介導與E-黏附蛋白間的相互作用參與細胞間的黏附。β-連蛋白磷酸化破壞了E-黏附蛋白/β-連蛋白復合物的結構，導致細胞黏附力下降，使腫瘤細胞浸潤、轉移的能力增強。

Ras/MAPK通路受體酪氨酸激酶是一類具有受體酪氨酸激酶活性的膜受體， 是小 GTP結合蛋白超家族成員。MAPK主要參與細胞的增殖、分泌以及神經元分化等生物反應的調節。絲氨酸/蘇氨酸酶Raf信號作為Ras的效應物，其削弱TGF的生長抑制和誘導凋亡作用，強化TGF的致侵襲效應，從而誘導MDCK細胞發生EMT。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy Iinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路中PI3K的作用是使磷脂酰肌醇發生磷酸化，產生第二信使進入細胞內進行信號轉導。PI3K有2種激活方式，一種是通過Ras和p110直接結合，導致PI3K的活化；而另一種則是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用，引起構象改變而被激活。AKT是PI3K信號轉導通路的下游信號，活化的AKT可通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，進而調節細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移。

目前研究較多較成熟的信號通路下游有關EMT的轉錄因子主要是Snail、Slug、SIP1及Twist等。這類DNA結合蛋白可以通過同SIP1競爭性結合E-黏附蛋白基因啟動子部位的E-box連接序列，直接下調E-黏附蛋白及上調間質來源的波形蛋白表達，從而引起EMT。Twist還能直接增強Snail的表達促使腫瘤細胞發生EMT。

2 EMT相關microRNAs與腫瘤的惡性行為

microRNA是一類新發現的長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其與目標mRNA配對，導致目的mRNA發生降解。

2.1 EMT相關microRNAs與腫瘤侵襲轉移

侵襲和轉移是惡性腫瘤的重要特征，也是造成癌癥患者死亡的重要原因。腫瘤細胞發生EMT的直接后果包括細胞黏附能力下降、穿破基底膜進入血液循環、逃避免疫監視及在遠處部位定植生長等。

2.1.1 與腫瘤EMT負相關的microRNA分子

2007年，Hurteau等［7］發現microRNA-200c在乳腺細胞中的表達與E-黏附蛋白的表達呈負相關，由此人們逐漸將注意力轉移到miRNAs與腫瘤EMT相關標志物的關系上。隨后，Gregory等［8］又通過生物信息學方法對EMT中重要的轉錄因子ZEB1的 3’非翻譯區(3’UTR)與現已知的microRNA分子綁定序列進行預測分析，繼而進行驗證之后發現，microRNA-200家族在經TGF-β1誘導的腫瘤細胞發生EMT過程中下調，并且在乳腺癌細胞系中發現此現象。最近，Chen等［9］發現microRNA-429能通過調控ZEB1、VCAN、EPCAM、TSPAN13及CAV2等多種EMT相關基因，使高度惡性的卵巢癌OVCAR3細胞出現EMT，大大降低其侵襲能力。

Wiklund等［10］研究還發現在肌肉轉移性膀胱癌組織及低分化膀胱癌細胞系中，microRNA-200家族及microRNA-205同時表達沉默，在其相應的DNA轉錄區出現超甲基化，并且與不同膀胱癌分期呈明顯的相關性。Yu等［11］發現在胰腺癌中microRNA-200c以影響多種細胞上皮標志物表達的方式來調控EMT，從而降低胰腺癌細胞的轉移和侵襲能力。在200例不同分期的胰腺癌患者中發現microRNA-200c表達與患者的預后相關。日本學者Shinozaki等［12］發現microRNA-200家族在3種主要EBV相關性胃癌中隨著惡性程度的增加，microRNA-200家族的表達逐漸降低。體外實驗也證實了這個觀點，并且認為EBV感染與microRNA-200的前體表達水平有關。

Let-7是microRNA分子之一，與腫瘤EMT所導致的侵襲轉移現象相關。除了研究較多的microRNA-200家族和let-7家族，新發現與腫瘤EMT有關的其他分子陸續被提出。Li等［13］在乳腺癌相關體內和體外實驗中，通過抑制microRNA-448的表達，能觀察到明顯的EMT現象，可能與其靶向調控SATB1 (特別富含AT序列區域綁定蛋白1)基因，進而經過一系列機制增加Twist以及NF-κB的表達有關。Castilla等［14］通過基因芯片陣列技術分析了不同EMT惡性程度的子宮內膜癌組織的microRNA差異發現，microRNA-23b、microRNA-29c和microRNA-203同樣具備抑制腫瘤EMT的特征。

2.1.2 與腫瘤EMT正相關的microRNA分子

2008年，Kong等［15］發現microRNA-155的表達在TGF誘導的腫瘤EMT中增高，是通過SMAD4來調控轉錄活性的，并且在microRNA-155表達缺失的乳腺癌細胞中發現無法有效誘發EMT。在乳腺上皮細胞系誘發的EMT內部比較中發現microRNA-29a及microRNA-21，在間質樣細胞系中的表達明顯高于上皮樣細胞系。同時研究還發現TTP(1種RNA結合蛋白)的表達在表達Ras的乳腺腺瘤細胞中被microRNA-29a抑制從而發生EMT。而microRNA-21則是通過過表達SMAD依賴的轉錄調控基質從而使得乳腺癌MDA-MB-468細胞系發生EMT。此外microRNA-21還能被BMP-6調控抑制，從而降低癌細胞的侵襲力［16］，最近有研究報道它還能與microRNA-31共同通過抑制TIAM1的表達從而使得結腸癌細胞遷移力性顯著增強，從而獲得明顯的侵襲能力［17］。另外，microRNA-21激活TGFβ信號通路下游的AP1、ZEB1等轉錄因子不僅使得癌細胞發生EMT，還能通過調控細胞周期和細胞凋亡相關基因(例如TGFβR2、PDCD4、Cdc25A及PTEN等)來影響腫瘤細胞的侵襲轉移和抗凋亡能力［18-19］。

E-黏附蛋白下調是EMT的關鍵步驟和特征。Ma等［20］發現在癌細胞系SUM149中，microRNA-9能增加EMT中細胞間質來源標志物的表達，下調上皮標志物E-黏附蛋白。體內試驗證實其通過增加腫瘤細胞-基質間的相互作用的敏感性等微環境來使得腫瘤更具侵襲力。此外，Meng等［21］在肝癌細胞中發現，microRNA-194在肝組織分離出的上皮樣細胞中表達較高，而在有高遷移特性的兩種間質樣星狀細胞和Kupffer細胞中幾乎不表達。同樣在肝癌的體外實驗中，間質樣肝癌細胞系無法檢測到microRNA-194的表達，用實驗方法將其過表達后，癌細胞的侵襲性明顯降低。

Vetter等［22］報道在MCF7乳腺癌細胞系中，microRNA-661能通過調控Nectin01和StarD10基因的轉錄，直接影響癌細胞在SNAI1誘導的EMT中體現的惡性程度。

2.2 EMT相關microRNA與腫瘤耐藥

惡性腫瘤發生EMT之前主要被認為與更強的遷移和侵襲能力有關。隨著研究不斷深入，人們發現在腫瘤發生EMT的過程中，細胞表型的變化及有關信號通路及轉錄因子的改變與腫瘤對化療藥物的治療反應間存在聯系，使得EMT在惡性腫瘤的治療評估中開始有著越來越突出的地位。而其中microRNA作為有著轉錄后調控功能的重要小分子，在這一領域發揮著重要作用。

隨著放療或化療的進行，或在缺氧等應激情況下，多種腫瘤細胞能通過逐漸發生EMT來逃避治療所導致的凋亡，進而使得細胞具有更強的轉移特性。在對紫杉醇耐藥的多種人類腫瘤細胞中，比如鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌等，EMT中關鍵轉錄因子TWIST的上調是一個共同現象［23］，并且在對吉西他濱和紫杉醇同時耐藥的胰腺癌細胞中，在上調TWIST的基礎上可同時發現有Snail的表達增強。Yang等［24］在一項使用奧沙利柏長期慢性刺激結腸癌細胞的實驗中證實其出現了耐藥性增強，且有逃避轉移現象，EMT現象在分子水平和形態學上都有極為明顯的改變，為耐藥性結腸癌細胞與EMT之間的關系提供了證據。

Shrader等［25］曾在建立的20多種不同表型及惡性程度的尿道癌細胞系中進行了藥物敏感性實驗，即對抗腫瘤化療藥物吉非替尼所導致的生長抑制程度的比較，發現在近一半對藥敏感的癌細胞系中表皮生長因子受體(EGFR)水平相對較低，其重要的EMT標志物E-黏附蛋白表達明顯比耐藥組高。又有研究發現在膀胱癌細胞系中對利妥昔單抗治療敏感的細胞系多高表達E-黏附蛋白。通過RNA干擾技術使E-黏附蛋白表達降低從而獲得更強的腫瘤EMT表型后，觀察到腫瘤細胞對利妥昔單抗表現出更明顯的耐藥現象［26］。

Adam等［27］發現在膀胱癌中，microRNA-200c調控ERRFI-1的表達，后者是EGFR通路上的抑制因子。由于EGFR在多數上皮腫瘤中表達較高，EGFR的抑制很久以來被當作腫瘤治療藥物的一個靶點，microRNA-200c由此降低EGFR通路下游轉錄因子ZEB1、ZEB2的表達，導致E-黏附蛋白表達增加從而降低癌細胞發生EMT的程度。由此觀察到microRNA-200c增強了膀胱癌細胞對基于EGFR抑制原理的普通化療藥物的敏感性。Nam等［28］發現microRNA-200c的下調提示卵巢癌患者化療敏感性極低，預后更差，術后生存期也相應縮短。在對西妥昔單抗和順鉑耐藥的非小細胞肺癌的研究中，Ceppi等［29］發現，該類肺癌細胞間質來源標志蛋白表達非常高， EMT現象特征十分明顯，還發現其啟動子區的超甲基化是導致microRNA-200c表達低下的原因；并通過將microRNA-200c過表達能部分恢復細胞對順鉑治療的敏感性并降低其侵襲能力。最近Tryndyak等［30］發現在耐多柔比星治療的乳腺癌細胞中，其表達的microRNA-200家族除抑制ZEB1轉錄因子外，還可能通過抑制SIRT1表達間接地使E-黏附蛋白啟動子的組蛋白乙酰化，從而使癌細胞的EMT表型變化，改變其耐藥和侵襲轉移能力。

Li等［31］將數種不同的胰腺癌細胞歸類成吉西他濱耐藥及敏感兩類，在其之間進行microRNA陣列芯片分析及后續驗證實驗后發現，microRNA-200家族和let-7家族使得胰腺癌細胞EMT與耐藥有著密切的關系。同樣通過基因芯片技術還發現，microRNA-214、microRNA-130a、microRNA-27a和microRNA-451也與卵巢癌的耐化療藥物有關［32］。通過對環磷酰胺、表柔比星、氟尿嘧啶聯合或單用化療耐藥并且用藥后出現新轉移灶的一批乳腺癌患者的研究發現，其體內腫瘤細胞較對照組細胞呈更典型的EMT表型狀態，且其microRNA-448表達明顯下調。研究認為microRNA-448是通過作用于其靶基因SATB1，增加雙調蛋白表達水平，進而增加了EGFR受體調控的EMT關鍵轉錄因子——Twist的表達，并且激活NF-κB通路來實現該類腫瘤細胞的高耐藥性和強侵襲性。在研究治療腫瘤藥物方面，最近Oliveras-Ferraros等［33］發現曾經作為糖尿病治療藥物的二甲雙胍在對乳腺癌細胞MCF-7進行誘導處理后，能對細胞產生抑制EMT的作用，降低其侵襲轉移能力。同時還發現EMT相關microRNA分子Let-7a及microRNA-96明顯上調。對處理前后的細胞樣本進行miRNA芯片篩選后發現，microRNA-181a與TGFβ信號通路及乳腺癌細胞對藥物敏感性有關，從而引起EMT相關的腫瘤細胞自我更新。

3 結語

越來越多的研究報道已經提示，EMT與腫瘤的侵襲轉移和耐藥有關。此外，隨著實驗技術的進步，特別是對microRNA機制研究的不斷加深，如今對腫瘤EMT在各領域的認識，將與不斷涌現的新研究概念結合起來，從而在診斷和治療上取得突破。隨著Krutzfeldt等［34］發現能在機體內沉默特異性microRNA的方法，為未來基于腫瘤EMT相關的microRNA的治療提供了新希望。目前，提供更明確的臨床證據以及闡明與各種復雜通路途徑的交互作用機制，是了解腫瘤與EMT關系的難點和重點，仍需要大量研究和深入探討。

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