CAV1基因沉默增強MCF-7多細胞球對多柔比星的敏感性

顧棟樺 平金良 董吉順 朱榮 陳琦

1. 浙江省湖州市中心醫院病理科，浙江 湖州 313000；2. 復旦大學上海醫學院病理學系，上海 200032

腫瘤化療耐藥是導致腫瘤治療失敗的重要原因，因此深入了解腫瘤耐藥的機制是提高腫瘤臨床化療療效的重要基礎。細胞質膜微囊蛋白-1 (caveolin-1，CAV1)是細胞質膜微囊的主要功能蛋白，能與細胞膜上許多生物活性蛋白結合并調節細胞的生命活動，也與腫瘤細胞的耐藥相關［1-2］。本研究以體外三維培養的MCF-7多細胞球作為模型，運用RNA干擾技術沉默CAV1基因的表達，觀察MCF-7多細胞球對多柔比星耐藥性，并對其機制作初步的探討。

1 材料與方法

1.1 乳腺癌MCF-7細胞單層培養

乳腺癌MCF-7細胞株購于中國科學院細胞資源中心，細胞在37 ℃、CO2體積分數為5%、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(Gibco公司，美國)培養。

1.2 MCF-7多細胞球模型的建立

按細胞三維培養方法(liquid overlay technique)獲得MCF-7多細胞球：首先用無血清培養液RPMI-1640溶解稀釋瓊脂糖至1.5%濃度，滅菌后在細胞培養皿上鋪一淺層，冷卻凝固后用于細胞接種；單層貼壁培養的MCF-7細胞處于生長對數期時，用胰酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞密度至5×105/mL接種于上述培養皿中，輕輕震蕩后置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中，每24 h半量換液，相差顯微鏡觀察多細胞球生長情況，培養3 d后形成大小較一致的MCS，直徑約100～150 μm，用于實驗。

1.3 RNA干擾CAV1 mRNA的表達

特異針對CAV1基因及非特異性陰性對照雙鏈小RNA(siRNA)購于美國Santa Cruz公司，轉染方法按試劑說明書進行：MCF-7細胞生長于6孔板至60%～70%匯合，用無血清培養液靜置24 h，5 μL siRNA與5 μL RNA干擾轉染試劑(Santa Cruz公司，美國)混合于190 μL無血清的RPMI-1640培養液，靜置30 min后滴加到培養皿中，溫育6 h后，添加10%胎牛血清的培養液繼續溫育24 h，棄去培養液重新用含10%胎牛血清的培養液培養24 h后，小心消化細胞成單細胞懸液，再按上述三維培養的方法得到多細胞球用于實驗。

1.4 細胞生長抑制率的檢測

單層MCF-7細胞消化制成單細胞懸液，調整細胞密度，接種于24孔板中；三維培養的細胞先取部分多細胞球吹散成單細胞懸液，細胞計數，然后按與單層培養細胞相同的細胞密度接種于1.5%瓊脂糖鋪底的24孔板中；各組細胞接種6 h后用終濃度分別為0.001、0.01、0.1、1及10 μmol/L的多柔比星(海正藥業有限公司，浙江)作用24 h，以無多柔比星的細胞培養液作為陰性對照；細胞經胰酶消化后吹散成單細胞懸液，與等體積0.02%臺盼藍混合，顯微鏡不同視野計數300個細胞及活細胞數。細胞生長抑制率=(1-多柔比星作用組活細胞數/陰性對照組活細胞數)×100%。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.5 RT-PCR檢測

Trizol試劑(生工生物工程有限公司，上海)提取細胞總RNA，cDNA合成按M-MLV逆轉錄酶(Invitrogen公司，美國)操作說明書進行，PCR擴增CAV1 mRNA，并以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH)作為內參照，引物由Primer 5.0軟件設計，上海生工生物工程有限公司合成，CAV1引物：上游引物5’-ACATCTCTACACCGTTCCCAT-3’，下游引物5’-TGTGTGTCCCTTCTGGTTCTG-3’，產物長度206 bp；GAPDH引物：上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，產物長度208 bp；反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，26個循環，最后72 ℃延伸10 min。Taq酶為美國Promega公司產品，PCR產物經1.5%瓊脂糖電泳分離后，溴乙錠染色，紫外燈下觀察。

1.6 蛋白免疫印跡檢測

收集細胞，經PBS清洗后，加入細胞裂解緩沖液，提取總蛋白，蛋白定量按BCA試劑盒(Pierce公司，美國)說明書進行。根據蛋白相對分子量選用合適濃度的膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳完畢，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入相應的一抗，37 ℃溫育1 h，洗滌后加入過氧化物酶標記的二抗，37 ℃溫育1 h ，最后用ECL法試劑盒(Pierce公司，美國)按產品說明書步驟顯色。條帶用Pro Analyzer 4.0軟件進行積分吸光度(IA)分析，以β-actin作為內參。一抗：兔抗人caveolin-1多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，工作濃度1∶1 000；鼠抗人Phospho-FAK (Tyr397)及FAK單克隆抗體(BD Bioscience公司，美國)，工作濃度1∶1 000；鼠抗人β-actin單克隆抗體(Sigma公司)，工作濃度1∶1 000；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠及兔的IgG9(鼎國公司，上海)，工作濃度1∶2 000，實驗重復3次。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 多細胞球形成增強MCF-7細胞對多柔比星的耐受能力

MCF-7細胞在體外三維培養3 d后形成直徑約100 μm、較為致密的多細胞球體(圖1A)。用不同濃度的多柔比星作用24 h，結果顯示0.001、0.01 μmol/L多柔比星作用時，單層細胞組與多細胞球組的細胞抑制率差異沒有統計學意義；隨著藥物濃度的增加，0.1、1及10 μmol/L多柔比星作用時，多細胞球組的細胞抑制率分別為單層細胞組的36.01%(t=9.72，P＜0.01)、46.75%(t=8.27，P＜0.01)和53.92%(t=7.01，P＜0.01)，組間比較差異有顯著統計學意義 (圖2)。

2.2 多細胞球形成對CAV1表達及FAK磷酸化水平的影響

MCF-7細胞形成多細胞球后，CAV1 mRNA及蛋白水平與單層細胞相比差異無統計學意義，總FAK蛋白水平未見明顯改變，但磷酸化FAK(p-FAK)蛋白水平上調(圖3)；多細胞球組FAK相對磷酸化水平(p-FAK/總FAK)為單層細胞組的3.64倍(t=7.32，P＜0.01)。

圖1 MCF-7細胞三維培養3 d后形成的多細胞球體Fig.1 MCF-7 multicellular spheroids after 3-day 3D culture(×200)

圖2 不同濃度的多柔比星處理24 h后的細胞抑制率Fig.2 Cell inhibitory rate after treatment with ADM at different concentrations for 24 h

圖3 免疫印跡法檢測蛋白水平Fig.3 Level of proteins expression assessed by Western blot

2.3 RNA干擾CAV1基因效率的鑒定

用脂質體法轉染siRNA能明顯抑制MCF-7細胞CAV1基因表達，RT-PCR擴增26個循環后未檢測到CAV1 mRNA產物條帶；轉染組與未轉染組相比，轉染組CAV1蛋白水平下降67.6%(t=14.19，P＜0.01)；與RNA干擾對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01，圖4)。

圖4 RNA干擾CAV1基因后的鑒定Fig.4 Effects of siRNA on the expression of CAV1 in both mRNA and proteins

2.4 RNA干擾CAV1基因降低多細胞球多柔比星耐藥性

RNA干擾CAV1基因表達后，MCF-7細胞之間相互黏附能力下降，三維培養3 d后形成的多細胞球較小并且松散，球體增長緩慢(圖1B)。用1 μmol/L的多柔比星作用24 h，單層細胞組細胞抑制率明顯高于未轉染多細胞球組(t=10.01，P＜0.01)；與未轉染組多細胞球相比，干擾組多細胞球的細胞抑制率增加了1.07倍(t=5.77，P＜0.01)，干擾對照組未見明顯改變(圖5)。

2.5 RNA干擾CAV1基因降低FAK磷酸化水平

免疫印跡法檢測結果顯示，與未轉染組多細胞球相比，RNA干擾組多細胞球總FAK蛋白水平未見明顯變化，p-FAK蛋白水平明顯下降，相對磷酸化水平下降68.7%(t=6.57，P＜0.01)，RNA干擾對照組未見明顯差異(圖3)。

圖5 多柔比星(1 μmol/L)處理24 h后的細胞抑制率Fig.5 Cell inhibitory rate after treatment with ADM (1 μmol/L) for 24 h

3 討 論

體內存在的實體腫瘤是一個三維的多細胞群體，細胞與細胞、細胞與外基質的相互作用以及腫瘤的微環境因素都會影響腫瘤的生物學特性。因此，三維培養的多細胞球比單層培養的細胞更接近于腫瘤的真實狀態。目前研究發現腫瘤細胞形成多細胞球后，對多種化療藥物的敏感性降低，而這種耐受能力的增強不是由于藥物不易進入到球體內所致，這種耐藥現象被稱為“多細胞耐藥(multicellular resistance，MCR)”［3］。MCR現象在許多研究中被證實，例如卵巢癌［4］、結腸癌［5］及肺癌［6］等，其機制還不清楚，可能與細胞黏附分子及相關通路的激活有關［3］。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一個多功能的非受體型酪氨酸激酶，在細胞之間及細胞與基質黏附中起關鍵的作用，FAK及下游信號通路的激活可以促進腫瘤細胞的生長和侵襲［7］。陳玉英等［5］用RNA干擾方法沉默FAK基因，發現可以下調Akt/NF-kB通路的活性水平，從而逆轉大腸癌細胞的MCR現象，說明FAK在MCR的形成中起著重要的作用。

本研究成功建立了乳腺癌MCF-7細胞三維培養模型，比較多柔比星對單層培養和三維培養的MCF-7細胞的抑制率，結果顯示多細胞球組對多柔比星的敏感性明顯下降。通過免疫印跡法檢測發現，雖然總FAK在形成多細胞球后沒有明顯改變，但FAK的磷酸化水平顯著增加，提示FAK激活可能是MCF-7多細胞球耐藥性增強的重要機制。

細胞質膜微囊是細胞膜上燒瓶樣的小凹結構，聚集著許多信號轉導相關蛋白，作為一個信號分子調節平臺，一方面起著募集蛋白的作用，使它們之間更容易發生相互作用；另一方面也把各種蛋白隔離開來，使它們在特定的條件下才被激活，從而使細胞生命活動協調有序的進行，CAV1蛋白在其中扮演著非常重要的角色［2］。CAV1在腫瘤細胞黏附和相關信號通路中起著調節作用，可以穩定FAK的活性［8-9］。另外，不少研究發現CAV1在許多耐藥的腫瘤細胞系中表達增強，說明CAV1可能與腫瘤耐藥相關［2］。本研究用雙鏈小RNA干擾的方法有效沉默了MCF-7細胞CAV1基因的表達后，細胞之間的黏附能力明顯下降，形成的細胞球小而且松散，球體增長緩慢；FAK的相對磷酸化水平被抑制；MCF-7多細胞球對多柔比星的耐藥性發生了很大程度上的逆轉。但與單層細胞相比，多細胞球中CAV1無論在mRNA水平還是蛋白水平上都未見明顯改變。因此，研究推測CAV1在MCF-7多細胞耐藥的形成中起著細胞間黏附及相關信號通路調節平臺的作用，干擾CAV1基因的表達可以影響耐藥相關信號通路的活性，逆轉多細胞球的耐藥表型，其具體的機制還需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究結果表明，多細胞球的形成可以增強MCF-7細胞對多柔比星的耐受性；RNA干擾CAV1基因的表達可以逆轉MCF-7多細胞球對多柔比星的耐藥現象，FAK磷酸化水平的下調可能是其重要的機制。

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