血清拉曼光譜檢測在鼻咽癌早期診斷中的應用價值研究

潘建基 陳奇松 黃偉 林少俊 蘇穎 力超 馮尚源 陳榮

1.福建醫科大學教學醫院，福建省腫瘤醫院放療科，福建 福州 350014；2.福建師范大學物光學院，福建 福州 350007

拉曼光譜是印度物理學家拉曼在1928年研究純苯溶液的光散射現象時發現的［1-2］，能反映物質內部分子的振動和轉動能級等結構信息。每一種物質分子都有自己特定的拉曼光譜，可根據不同樣品特性選擇不同的激發波長，且不受水溶液影響。將任何一種物質材料作為散射物質，幾乎都可以得到相應的拉曼光譜。目前拉曼光譜技術已用于肺癌［3］、乳腺癌［4］、前列腺癌［5］、皮膚癌［6］等體內多種腫瘤的早期診斷。本研究探討血清拉曼光譜的特點，并分析其在鼻咽癌早期診斷中的應用價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集2009年5月—2009年12月于本院診治的29例經病理確診為鼻咽癌的初診患者(鼻咽癌組)和36例健康志愿者(健康對照組)的血清樣品。鼻咽癌組患者的病理分類：非角化性未分化型癌27例，非角化性分化型癌1例，低分化鱗癌1例。入組標準：⑴經病理證實的鼻咽癌患者；⑵采血前未行抗腫瘤治療；⑶無其他腫瘤；⑷能配合完成檢查并簽訂知情同意書。健康對照組入組標準：⑴健康體檢者，無腫瘤病史，且EB病毒血清學檢查陰性及鼻咽鏡檢查正常者；⑵志愿并能配合完成檢查，同時簽訂知情同意書(本研究符合人體試驗倫理學標準，得到醫院倫理委員會的批準)。

1.2 血清樣品制備

所有入組的鼻咽癌患者和健康志愿者在禁食12 h后，于次日凌晨6～8時抽取外周靜脈血2～4 mL，盛放于血常規管中。所有的血液樣品經1 000 r/min，r=9.5 cm，離心10 min后去除血細胞，取上清液獲得血清樣品。在拉曼光譜測試之前，吸取20 μL血清樣品，滴于干凈的鋁片上，在4 ℃冰箱中放置2 h左右至樣品自然變干。

1.3 光譜測量

晾干后的血清樣品采用inVia型共聚焦顯微拉曼光譜儀進行測量。光譜范圍是600～1 800 cm-1，激發光源為半導體激光器發出的785 nm波長的激光。拉曼光譜系統在測量前使用標準硅片的520 cm-1進行定標。激光照射在樣品上的功率為50 mw，積分時間為30 s。每個樣品測4～5個點。

1.4 光譜信號處理

將測量的所有拉曼光譜經平滑除去噪聲，再將平滑后的光譜減去熒光背景，得到純的拉曼光譜信號。此后，這些光譜均進行面積歸一化，以消除激光功率波動和焦面偏移的影響。最后將同一樣品的多條光譜進行平均以代表該患者或健康志愿者的血清拉曼光譜信號。

1.5 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行處理與分析。計量資料用表示。對兩組血清拉曼光譜數據進行主成分分析和判別分析。繪制判別分析結果的受試者工作特性曲線(receiver operator characteristic curve，ROC)，并進行ROC曲線分析。

2 結 果

2.1 兩組血清的平均拉曼光譜的外形比較

為了更直觀地比較兩組光譜的差異，分別取兩組血清的平均拉曼光譜。

結果顯示，兩組血清的平均拉曼光譜形態及譜峰位置相似，但在約900～1 000 cm-1及1 600～1 700 cm-1波段，健康對照組的血清拉曼光譜的譜峰強度高于鼻咽癌組，而在1 200～1 400 cm-1波段，健康對照組的血清拉曼光譜的譜峰強度低于鼻咽癌組(圖1)。

圖1 鼻咽癌患者、健康志愿者血清的平均拉曼光譜圖及兩者光譜差異圖Fig.1 The mean and difference spectrum of the two groups

2.2 兩組血清光譜的主成分分析結果

多元統計方法主成分分析(principal components analysis，PCA)［7］是將多個實測原始變量轉換為少數幾個不相關的綜合指標的多元統計方法，其主要過程如下：⑴指標數據標準化(SPSS統計軟件自行處理)；⑵各指標間相關性判定；⑶確定主成分個數(累積貢獻率通常以＞70%為宜) ；⑷計算各樣品主成分得分。主成分分析后，首先比較兩組血清樣品主成分得分情況(表1)。

表1 兩組血清樣品的主成分得分比較Tab.1 Comparison of scores of PC for the serum samples of the two groups

取兩組血清樣品的第1、2、3主成分得分制作散點圖(圖2、圖3)。結果提示各血清樣品的第1、2、3主成分對兩組的血清均具有較好的聚類作用。

2.3 兩組血清光譜的判別分析結果

經主成分分析降維處理后，選取兩組血清樣品中累積貢獻率為69.69%的前7個主成分得分進一步進行判別分析，同時作交叉檢驗。結果顯示兩組血清樣品判別得分健康對照組為-1.27±0.92，鼻咽癌組為1.57±1.10(P=0.00)。兩組血清樣品陽性預測值為89.7%(26/29)，陰性預測值為91.7%(33/36，表2)。

圖2 兩組血清主成分分析二維散點圖Fig.2 2D plot using scores of PC1 and PC2

圖3 兩組血清主成分分析三維散點圖Fig.3 3D plot using scores of PC1, PC2 and PC3

表2 兩組血清樣品的判別結果Tab.2 The discrimination result for the serum samples of the two groups[n(%)]

2.4 ROC曲線分析

以兩組血清的判別得分來構建ROC曲線，縱座標為靈敏度，橫座標為1-特異度。其ROC曲線下面積為：0.971，提示判別分析結果準確性高(圖4)。

圖4 兩組血清判別得分構建ROC曲線Fig.4 The ROC cruve of the discrimination result for the serum samples of two groups

3 討 論

鼻咽癌流行病學具有明顯的地域特征，我國南方地區高發。目前EB病毒抗體及DNA酶血清學檢測已在臨床篩查診斷中普遍應用，由于其敏感性和特異性欠佳［8］，故應用價值有限。Tsang［9］等在評價EB病毒殼抗原抗體(EBVCA-IgA)及早期抗原抗體用于篩查鼻咽癌的研究中發現EB-VCA-IgA靈敏度可達89%，但假陽性高達50%，而EB-EA-IgA的靈敏度只有63%。作者認為在鼻咽癌高發地區EB-VCAIgA不宜單獨用于鼻咽癌的早期篩查診斷。雖然近年來文獻報道鼻咽癌患者血清EBV-DNA濃度對鼻咽癌的診斷、預后等判斷具有一定意義，但目前血清EBV-DNA的檢測在不同的實驗室之間檢出率不一致［10］，重復性欠佳，單獨作為鼻咽癌早期篩查診斷方法仍不理想。鼻咽癌的治療效果與臨床分期密切相關，筆者［11］在回顧性分析1995年—1998年1 706例鼻咽癌的遠期療效表明，Ⅰ期患者5年生存率為100%，Ⅱ期為75.9%，Ⅲ期為66.5%，Ⅳ期為49.3%。因此早期發現、早期診斷、早期治療是非常重要的，可顯著提高鼻咽癌患者生存率和生活質量。

激光拉曼光譜技術是利用激光與樣品內部粒子(如分子、原子、電子等)相互作用后產生的特征性峰譜來鑒別樣品的一門光譜技術。它具有高分辨率、無損、快速等優點［1-2］，可以探測到組織細胞中蛋白質、核酸、脂類等生物大分子的結構信息及含量的變化。通常一條拉曼光譜所包含的物質成分信息可通過對譜峰的組成、峰位、峰寬及峰強等的變化表現出來，譜峰組成及強度高低一般與待測樣品內成分的性質與含量多少密切相關。2006年Pichardo-Molina等［4］利用拉曼光譜技術及主成分分析與判別分析等多元統計方法研究乳腺癌患者及健康人血清樣品的拉曼光譜，結果顯示其靈敏度為97%，特異度為78%。

本研究結果提示兩組血清成分存在質或量的差異，這也成為進一步利用多元統計方法來區別兩者的依據之一。Hanlon等［1］報道多元統計方法主成分分析(principal components analysis，PCA)可用于對光譜數據進行處理。通常一個樣品的拉曼光譜含有的變量(即波數)均為上千個，而主成分分析法PCA［7］是從多個數值變量之間的相互關系入手，利用降維的思想，將多個變量化為少數幾個互不相關的綜合變量的一種統計方法。這些綜合指標不僅保留了原始指標的主要信息，且又互不相關。故該法適合于分析拉曼光譜數據。

總之，激光拉曼光譜技術是一種無創、快速、高靈敏度的光譜檢測方法。本研究結果顯示，激光拉曼光譜技術能很好地鑒別鼻咽癌患者及健康人血清，但在臨床應用方面目前需解決以下的問題：⑴本研究通過主成分及判別分析雖能有效區分鼻咽癌與健康人的血清，但目前尚未知區分二者的血清成分或生物大分子；⑵本研究中血清樣品的數量尚偏少，雖然研究結果令人鼓舞，但需大宗樣本來檢驗可能存在的結果偏倚；⑶本研究未將多元癌或其他癌癥患者的血清樣本納入對比研究，故結果較局限，今后需開展其他腫瘤的血清拉曼光譜對比研究。

［1］ HANLON E B, MANOHARAN R, KOO T W, et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy［J］. Phys Med Biol, 2000,45(2)： 1-59.

［2］ http：//cbst.ucdavis.edu/education/courses/winter-2008-eadbim-289/burger_jan_24_bioraman_afm.pdf.

［3］ YAMAZAKI H, KAMINAKA S, KOHDA E, et al. The diagnosis of lung cancer using 1064-nm excited near-infrared multichannel Raman spectroscopy［J］. Radiat Med, 2003,21(1)： 1-6.

［4］ PICHARDO-MOLINA J L, FRAUSTO-REYES C,BARBOSA-GARCIA O, et al. Raman spectroscopy and multivariate analysis of serum samples from breast cancer patients［J］. Lasers Med Sci, 2007; 22(4)： 229-236.

［5］ CROW P, BARRASS B, KENDALL C, et al. The use of Raman spectroscopy to differentiate between different prostatic adenocarcinoma cell lines［J］. Br J Cancer, 2005, 92(12)：2166-2170.

［6］ NIJSSEN A, BAKKER SCHUT T C, HEULE F, et al.Discriminating basal cell carcinoma from its surrounding tissue by Raman spectroscopy［J］. J Invest Dermatol, 2002,119(1)： 64-69.

［7］ 孫振球, 徐勇勇. 醫學統計學［M］. 第2版. 人民衛生出版社, 2006： 415-421.

［8］ 洪明晃. 鼻咽癌的篩查問題［J］. 實用腫瘤學雜志, 2004,19(4)： 275-276.

［9］ TSANG R K, VLANTIS A C, HO R W, et al. Sensitivity and specificity of Epstein-Barr virus IGA titer in the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma： a three-year institutional review［J］. Head Neck, 2004, 26(7)： 598-602.

［10］ 楊德輝, 柳青. 鼻咽癌患者血漿游離EBV DNA檢測的研究現狀［J］. 中山大學研究生學刊(自然科學與醫學版),2006, 27(1)： 1-6.

［11］ 潘建基, 張瑜, 林少俊, 等. 1706例鼻咽癌放療遠期療效分析［J］. 中華放射腫瘤學雜志, 2008, 17： 247-251.