癌睪丸抗原OY-TES-1在腦膠質(zhì)瘤中的表達及其抗體血清學分析

李希圣 嚴峻 羅彬 賀菽嘉 范蓉 林永達羅昱 肖紹文 謝小薰,4

1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學組胚教研室，廣西 南寧 530021；3.廣西中醫(yī)學院組胚教研室，廣西 南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學中心實驗室，廣西 南寧 530021

*：現(xiàn)工作單位為濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 濱州 256600

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，目前的治療仍以手術為主，放、化療為輔。盡管這些傳統(tǒng)的治療方法已有了很多改進，但是患者的中位生存期仍不足1年［1］。免疫治療是一種新的輔助治療方法，目前已用于腫瘤治療，具有一定的臨床療效［2］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)一直被認為是一個免疫豁免區(qū)，但近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，惡性腦腫瘤常伴有血-腦脊液屏障破壞，免疫細胞穿越血-腦脊液屏障進入腦組織，以及腦組織的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)表達上調(diào)，這一現(xiàn)象提示開展腦腫瘤免疫治療具有一定的可能性［3］。

癌睪丸(cancer-testis，CT)抗原是一類在多種腫瘤組織表達的抗原［4］。目前一些CT抗原如Mage-A1、A3的腫瘤疫苗已進入臨床實驗，在一些顱外腫瘤的治療中收到了較好的療效［5］。由于膠質(zhì)瘤低表達或不表達這些CT抗原而制約了將其用于膠質(zhì)瘤免疫治療。因此，有必要對一些新篩選出的CT抗原做進一步的研究，探討哪些CT抗原具有用于膠質(zhì)瘤免疫治療的可能性。

OY-TES-1是CT抗原家族中的一員［6］。根據(jù)它在CT抗原數(shù)據(jù)庫中的排名，又稱為CT23。最近的研究發(fā)現(xiàn)，OY-TES-1蛋白與有絲分裂紡錘體蛋白NuMA相互作用，導致細胞惡性轉(zhuǎn)化，抵抗化療藥物紫杉醇的作用［7］。為了解OY-TES-1在膠質(zhì)瘤的表達情況及是否具有免疫原性，本研究初步檢測了OY-TES-1 mRNA和血清抗體，并結(jié)合臨床病理指標進行分析。

1 材料和方法

1.1 標本和主要試劑

膠質(zhì)瘤患者腫瘤標本及配套血清51例，其中男性32例，女性19例，年齡8～65歲，中位年齡35歲，均來自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2004年—2008 年的住院患者；所有腫瘤標本均經(jīng)病理檢測確認，收集血清標本之前患者均未接受任何治療。健康人血清107例來自廣西醫(yī)科大學學生。

RNA提取試劑盒(北京天根生化公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)，Cellstar 96孔酶標板(Greiner bio-one公司)，生物素-山羊抗人IgG單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(HRP-streptavidin)(美國KPL公司)，TMB(美國Sigma公司)。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

取50～100 mg于-80 ℃保存的組織，迅速加入裂解液，電動勻漿儀勻漿，步驟按公司提供的說明書進行。所得RNA溶于無RNA酶的純水中，電泳檢測RNA質(zhì)量，無明顯18 S和28 S者予以舍棄。取2 μg總RNA，進行cDNA合成，所得的cDNA用P53引物作PCR擴增以檢測其質(zhì)量。P53引物序列及PCR反應條件參照文獻［8］。

1.3 目的基因RT-PCR擴增

PCR反應體系為30 μL，包括1 μL cDNA、上下游引物各1 μL、dNTPs、Taq DNA聚合酶及PCR緩沖液等，置反應物于PCR儀。OY-TES-1引物序列及PCR反應條件參照文獻［6］，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。每輪RT-PCR反應中，采用正常睪丸cDNA為陽性對照，同時設立不加模板的空白對照，以排除假陽性的可能性。

1.4 OY-TES-1融合蛋白制備

帶麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein，MBP)標簽的OY-TES-1重組質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建［9］。將OY-TES-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(42 ℃熱休克法)，接種單菌落于含0.2%葡萄糖、100 μg/mL氨卞青霉素的LB培養(yǎng)液，37 ℃劇烈振蕩至D600為0.5～0.7，取1 mL菌液作為誘導前對照，加入IPTG終濃度為0.5 mmol/L，30 ℃誘導表達2 h。收集菌液，4 ℃以5 000 r/min離心10 min(Sigma公司3K15離心機)，每克菌體沉淀加入3 mL過柱平衡液(20 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，1 mmol/LEDTA，10 mmol/L β-巰基乙醇)和50 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF) 8 μL，反復凍融3次，冰浴超聲裂解細菌，在4 ℃以12 000 r/min離心20 min(Sigma公司3K15離心機)，收集上清液并加入Amylose Resin親和層析柱中，隨后加入12倍柱床體積的過柱平衡液，以洗去非特異結(jié)合的蛋白，最后用10 mmol/L麥芽糖洗脫緩沖液過親和層析柱，收集含OYTES-1融合蛋白洗脫液。測定D280，SDS-PAGE電泳鑒定純度，將含有融合蛋白的洗脫液合并收集，待濃縮凍干。

1.5 ELISA檢測

將1.0 mg/L的OY-TES-1融合蛋白加入酶標板(100 μL/孔)，4 ℃包被過夜。用PBST(PBS含0.05% Tween-20)在室溫下洗板3次，50 g/L脫脂奶于37 ℃封閉1 h，上待檢血清(1∶400)于37 ℃溫育1 h，隨后用IgG單克隆抗體(1∶10 000)于37 ℃溫育1 h，洗板后加入HRP-streptavidin(1∶1 000)，37 ℃溫育30 min，再次洗板加TMB避光顯色15 min，用1 mol/L硫酸終止反應。酶標儀(美國Thermo公司)測定D450值。以包被MBP為陰性對照，進行統(tǒng)計學分析。以大于健康人平均吸光度值3個標準差者為陽性。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，樣本率的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 OY-TES-1 mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達

腦膠質(zhì)瘤OY-TES-1 mRNA陽性率為80.4%(41/51)，統(tǒng)計學分析顯示OY-TES-1 mRNA表達與腦膠質(zhì)瘤患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分級等參數(shù)無關(圖1，表1)。

2.2 血清抗體的檢測結(jié)果

ELISA檢測107例健康人血清抗體，吸光度均值為0.686±0.125；以健康人D450均數(shù)加3個標準差值為Cut-off值(1.061)，判定抗體陽性的血清。在所檢測健康人血清中無一例抗體陽性(圖2)。

圖1 OY-TES-1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of OY-TES-1 PCR products of glioma tissues

表1 OY-TES-1mRNA及其抗體與膠質(zhì)瘤相關臨床指標的關系Tab.1 Correlation between ACRBP/OY-TES-1 mRNA expression, sera antibody and clinicopathological features in glioma

51例腦膠質(zhì)瘤患者血清OY-TES-1抗體陽性率為15.7%(8/51)。抗體D50均值為0.811±0.283，明顯高于健康人血清抗體均值(P＜0.01)。在各種病理類型的膠質(zhì)瘤中，OYTES-1抗體陽性率各異；其中Ⅰ～Ⅱ級星型細胞瘤患者抗體陽性率為25%(4/16)、Ⅱ～Ⅲ級星型細胞瘤患者為11.1%(1/9)；1/2室管膜瘤、1/11多形性膠質(zhì)母細胞瘤和1/1髓母細胞瘤患者可檢測到OY-TES-1抗體；而間變性星型細胞瘤等6種膠質(zhì)瘤患者未檢測到OY-TES-1抗體(圖2)。

圖2 ELISA 檢測血清OY-TES-1抗體Fig.2 Detection of sera OY-TES-1 antibody with ELISA

3 討 論

本研究結(jié)果證實在腦膠質(zhì)瘤中OY-TES-1 mRNA亦有較高的陽性率。由于基因的轉(zhuǎn)錄還涉及到諸多調(diào)節(jié)機制，故mRNA的表達不能完全代表其蛋白的表達情況；目前有關OYTES-1蛋白在卵巢癌中表達率為69%［10］，在肝細胞癌中為40%［11］。因此，下一步尚需了解OY-TES-1蛋白在膠質(zhì)瘤中表達情況。

本研究結(jié)果同時證實膠質(zhì)瘤血清OYTES-1抗體的陽性表達率為15.7%(8/51)，同時再次證實在健康人血清中無相應的抗體，表明OY-TES-1抗體具有腫瘤特異性。盡管統(tǒng)計學分析顯示OY-TES-1抗體的出現(xiàn)與臨床指標無關聯(lián)，但值得注意的是，惡性程度高(Ⅲ～Ⅳ級)的膠質(zhì)瘤更易產(chǎn)生OY-TES-1抗體，這可能與腫瘤浸潤生長快、損傷血-腦脊液屏障嚴重有關。下一步需要擴大病例數(shù)，尤其是惡性程度高的膠質(zhì)瘤，同時需要對抗體進行動態(tài)的觀測，才能真正了解其臨床意義。此外，OYTES-1作為一種抗原能在膠質(zhì)瘤患者體內(nèi)引起體液免疫反應，但當它被MHC I類分子呈遞至腫瘤細胞的表面時，也有可能誘導產(chǎn)生細胞免疫反應。最近已有研究鑒定出一個OY-TES-1的HLA-A24 限制性抗原肽，用該抗原肽誘導的細胞毒T細胞(cytotoxic T cell，CTL)能在體外特異性地殺傷OY-TES-1 mRNA陽性的肺癌細胞株［12］。雖然這是一個體外實驗的研究，但提示OY-TES-1在體內(nèi)可引起細胞免疫反應。

本研究結(jié)果顯示，OY-TES-1 mRNA在膠質(zhì)瘤中具有較高的陽性率，并能在膠質(zhì)瘤患者體內(nèi)引起體液免疫反應，提示OY-TES-1用于膠質(zhì)瘤免疫治療具有潛在的臨床應用價值。

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