代謝組學及其在藥物安全評價中的應用進展

畢言鋒，汪 霞，徐士新，肖希龍

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081;2.中國農業大學動物醫學院，北京 100091)

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后出現的一門新學科，已成為系統生物學(systemic biology)的重要組成部分。與其他組學不同，代謝組學是對生物或細胞中所有低分子量(相對分子量小于1000)代謝產物進行定性和定量分析的一種系統生物學研究方法。1998年，Tweeddale等在大腸桿菌代謝研究中將代謝物組(Metabolome)簡單定義為“代謝物的整體(global metabolite pool)”，并發現代謝物組分析是一種揭示細胞代謝和整體調節的新手段［1］。1999年，Nicholson等在利用NMR進行大量生物代謝研究的基礎上提出了metabonomics的概念，被認為是代謝組學學科的正式誕生［2］。metabonomics(代謝組學)主要研究生物體對生物刺激或基因變異所引起的整體代謝物動態響應，更關注復雜多細胞體系隨時間的系統變化，早期主要應用于疾病診斷和藥物篩選等領域。2000年，Fiehn在植物代謝研究中使用了metabolomics(代謝物組學)的概念［3］，主要用于無偏差、非靶向的定性和定量分析生物體所有小分子代謝產物［4］，被認為是靜態的代謝物組分析。Nicholson教授認為metabonomics和metabolomics的區別更多表現在定義上，而非技術層面上，相關的技術手段和實驗模型在實際應用中已經逐漸融合統一［5］。目前，代謝組學已經廣泛應用于疾病診斷［6］、新藥研發［7］、食品安全［8］、植物代謝［9］和微生物代謝［10］研究等。隨著人類基因組計劃的完成和后基因組時代的來臨，代謝組學方法被認為是未來科學探索的新途徑之一，將有助于人們在基因水平上認識內源性物質變化和藥物作用的聯系［11－12］。

1 代謝組學的研究方法

完整的代謝組學流程包括樣品采集和預處理、樣品分析及數據分析處理等，其研究平臺主要由樣品分析平臺和數據處理平臺構成。

1.1 樣品分析平臺 在代謝組學的研究中最常見的樣品分析工具是核磁共振儀(NMR)和質譜儀(MS)［13－14］。核磁共振儀(特別是1H － NMR)能夠實現對樣品的非破壞性、非選擇性分析，滿足了代謝組學中對盡可能多的化合物進行檢測的目標。但是，它有靈敏度低、分辨率不高等缺陷［15］。氣相色譜聯用儀(GC/MS)主要優勢在于能夠提供較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有可供參考、比較的標準譜圖庫，可以方便地得到待分析組分的定性結果;其局限性表現在GC只能對揮發性組分實現直接分析，從而得不到體系中難揮發的大多數代謝組分的信息［16］。21世紀以來，液相色譜質譜聯用技術(LC/MS)逐漸被廣泛地用于代謝組學研究中［17－18］。與 GC/MS 相比，LC/MS 技術預處理相對簡單，可以滿足生物體內大部分小分子代謝物的高通量分析。目前，超高效液相色譜(UPLC)與高分辨質譜(如飛行時間質譜)聯用已經成為代謝組學研究的有力工具［19］。超高效液相色譜儀采用粒徑為1.7 μm的填料和能承受更大壓力(15000 psi)的液相色譜系統，極大地提高了分離能力和靈敏度。飛行時間質譜(TOF－MS)可以得到更精確的分子質量信息，有助于對代謝物的分子結構進行準確分析。

1.2 數據處理平臺 應用NMR或MS得到的代謝組學數據是海量的多變量數據信息，需要利用模式識別(PR，pattern recognition)技術進行多元數據分析，將數據降維，然后對樣本分類或尋找生物標志物(biomarker)，用來解釋代謝表型(metabolic phenotypes)與基因變異或外界刺激(如疾病或藥物)的關系［20－21］。常用的模式識別技術包括無監督(unsupervised)方法和有監督(supervised)方法兩類。無監督的模式識別方法的特點是不把描述的樣本特征量與分類屬性關聯起來建立模型，直接將具有相似特征的樣本進行分類，采用相應的可視化技術直觀地表達出來。主要的無監督模式識別方法包括簇類分析(Hierarchical Cluster analysis)、主成分分析(Primary component analysis，PCA)和非線形映射(Nonlinear Mapping，NLM)等。有監督模式識別方法是在已有分類信息的基礎上，建立樣本的特征屬性描述與樣本分類目標之間的關系，使各類樣品間達到最大的分離，并利用所建立的多參數模型對未知數據進行辨識、歸類和預測。主要的有監督模式識別方法包括人工神經網絡(ANNs)、偏最小二乘(PLS)、軟獨立建模分類法(SIMCA)、偏最小二乘－判別分析(PLS－DA)和正交偏最小二乘－判別分析(OPLS－DA)等。在代謝組學研究中，一般先采用無監督模式識別方法(如PCA)將未知樣品進行分類，初步尋找代謝指紋譜的差異組分。然后，在建立初步的分類模型的基礎上，有監督模式識別方法(如OPLS－DA)能夠消除各種非實驗因素的干擾，縮小臨床樣本的個體差異，減少系統誤差，篩選可能的生物標志物，最終把數學結果回歸成有化學意義的參數。

2 代謝組學方法在藥物毒理學研究中的應用

在藥物的安全評價中，傳統的藥物毒理學將藥物暴露與藥物引起的各種損傷終點直接聯系起來進行研究，對于藥物損傷的分子機制了解極其有限。代謝組學是利用高通量檢測技術在代謝物的整體水平上檢測機體在藥物暴露后的各種生理生化指標，這些指標幾乎涵蓋毒理作用發生的所有的環節，再結合傳統的病理學終點，可以對藥物的毒性作用機制進行深入的了解［22］。

在毒理代謝組學研究方面，Nicholson等最早將NMR與模式識別技術結合檢測代謝表型中的動態變化，并應用于藥物毒理標示物的研究［22］。由Nicholson教授主持，輝瑞等五大醫藥公司參與的Consortium for Metabonomic Toxicology(COMET)項目是利用代謝組學方法預測化學品毒性最有影響和代表性的研究。該研究利用NMR技術分析了約150種藥物(或化學品)對嚙齒動物尿液、血液和部分組織代謝組的影響，證明代謝組學方法應用于藥物毒理研究的可行性和穩定性，并建立了用于臨床前候選化合物的肝臟和腎臟毒性預測篩選的專家系統［23－24］。美國食品與藥品管理局(FDA)的“關鍵路徑機遇報告”(Critical Path Opportunities Report)認為，代謝組學是發現肝臟、腎臟和心臟等器官損壞的新生物標志物的重要實驗方法，有助于更深入地理解藥物毒性和疾病發生的機制［25］。目前，FDA已經接受代謝組學研究的結果作為新藥申報和注冊的重要參考指標。

近年來，基于NMR和MS技術的代謝組學方法逐漸被用于藥物毒理學研究中。Coen等采用基于高分辨NMR的代謝組學方法研究了對乙酰氨基酚的毒性作用，結果表明，高劑量的乙酰氨基酚會影響三羧酸循環中的丙酮酸代謝，并阻礙肝微粒體脂肪酸的 β －氧化過程，從而導致肝毒性［26］。Kumar等利用LC－TOFMS對降血脂藥阿托伐他汀代謝組學研究表明，雌酮、腎上腺皮質酮、脯氨酸、胱氨酸和組氨酸等為阿托伐他汀潛在的肝毒性標示物［27］。Xie等利用基于UPLC－QTOFMS的代謝組學方法，并結合血液生化分析和病理學特征，發現高劑量的三聚氰胺、低劑量的三聚氰胺和三聚氰酸混合物都具有較強的腎毒性及病理損害，主要是影響了色氨酸、多胺和酪胺的代謝及腸道菌群組成［28］。

代謝組學的系統生物學研究思想與中醫藥的整體治療觀念是一致的，因此，代謝組學方法也被應用于中藥毒性評價的研究中。Li等利用NMR技術研究中藥制品黑順片的毒理效應，發現尿液中的牛磺酸和N－三甲胺氧化物與對照組相比明顯減少，而檸檬酸鹽、戊酮異二酸、琥珀酸鹽和馬尿酸鹽的含量相對增加。同時發現毒性效應具有劑量依賴性和積累效應［29］。Chen等基于LC－MS和多元統計分析的代謝組學研究發現，馬兜鈴酸所致的快速進行性腎衰竭(rapid progressive renal failure)與代謝表型的變化有明確的聯系［30］。

以上的研究表明，毒理代謝組學方法與常規的毒理學評價方法具有較好的一致性，并且其敏感性優于常規毒理學檢測，為藥物安全評價提供了新思路和新途徑。

3 代謝組學在藥物代謝研究中的應用

從代謝組學的角度，生物體攝入一定劑量的藥物后，代謝物組(metabolome)包括自身代謝產生的內源性代謝物和藥物經生物轉化后的外源代謝物。毒理代謝組學的主要研究對象是外源物毒理作用引起的生物體內源性代謝物變化。理論上講，單次低劑量給藥時，藥物對生物體內源代謝的影響很小，給藥前后的體液樣品代謝組的主要差別為藥物代謝產物。在藥物代謝組學方法中，利用模式判別等多元統計分析技術，給藥前后的樣品可以被顯著區別開，而給藥后樣品組中的對分組貢獻較大的就是藥物主要代謝物［31］。

由于具有較高的分辨率和靈敏度，并易于進行結構確證等優點，LC/MS分析技術已被廣泛應用于復雜基質中藥物代謝物的分離和結構鑒定。2003年，Plumb等首次嘗試將高分辨質譜技術和多元數據分析方法應用于藥物代謝物的篩選，將空白和給藥樣品的LC－QTOFMS數據進行多元統計分析，在復雜的質譜信息中消除了內源性物質的干擾，在藥物結構未知的情況下，鑒定出了藥物代謝產物［32］。Chen等用代謝組學方法對雜環胺PhIP的體內代謝進行了研究，檢測到17種PhIP代謝，其中8種為其他方法未檢測到的新代謝產物［33］。Sun等應用基于LC/MS的代謝組學方法，快速鑒定了托卡朋(Tolcapone)的16種體內代謝物，其中，6種代謝物為首次發現［34］。以上研究表明，基于代謝組學方法的藥物代謝研究將高分辨分析儀器(如UPLC－TOFMS)和多元數據分析技術相結合，不局限于已知的特定代謝途徑，對藥物代謝物進行非靶向的全面篩選，有助于發現一些用傳統方法無法檢測到的新代謝產物，為藥物體內代謝研究提供了一種新的途徑。

4 代謝組學在獸藥安全評價中的應用前景

在新獸藥研發和安全評價中，代謝組學方法將有廣泛的應用前景。首先，代謝組學參數比傳統的毒理學生化指標更靈敏，因此，采用毒理代謝組學方法可以研究獸藥的不同劑量對動物內源性代謝物的影響，有助于更準確深入地了解獸藥的毒理學機制，確定獸藥作用機理和安全劑量，從而更有效地保障動物源食品安全。代謝組學技術可以為中獸藥藥理藥效研究提供科學依據，也為中獸藥的安全評價提供一種新的途徑。另外，作為一種非靶向、無偏的篩選技術，代謝組學方法可以用于獸藥體內代謝和殘留標示物的研究。在獸藥殘留監控中，禁用藥物(如類固醇激素、β－受體激動劑)的新化合物或多藥物低劑量聯合使用往往無法被常規的檢測技術發現。近年來，有研究嘗試利用代謝組學方法篩選禁用藥物長期使用后產生的內源性生物標示物［35］，為獸藥殘留監控提供了一種全新的檢測技術。

代謝組學研究現在處于快速發展的階段，無論是樣品分析和數據處理方法，還是多學科交叉應用都面臨著很多挑戰。同時，代謝組學方法僅僅是一個技術平臺，無法獨立進行生物機制研究，只有與其他的學科(如分子生物學、基礎醫學等)相結合才能發揮其強大的作用。隨著代謝組學研究方法的不斷完善，其在藥物研究中應用的深度和廣度會不斷增加，與蛋白質組學、轉錄物組學整合，將為準確全面地評價藥物安全性和藥理作用提供一種有力的工具。

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