蟾酥提取物微球制備及含量的測定

蘇麗英 劉國實 張澤兵 周小洲 王 瀾 韓 冰 才子斌

(武警吉林省總隊醫院口腔科，吉林 長春 130061)

聚乳酸-羥基乙酸共聚物〔Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA〕是近幾年來常被應用于控釋、緩釋給藥系統的載體材料。微球(microspheres)是一種藥物包裹于適宜的高分子材料或吸附于適宜的載體材料而制備的類球狀或球狀的微粒。蟾酥(Bufobufo gargarizans C antor)是我國傳統中藥，其性溫，味甘辛，有毒;具有消腫、止痛、開竅、醒神、解毒、強心等效用〔1〕。蟾酥中含有多種有效的化學成分，包括蟾毒色胺類和蟾毒配基類化合物，以及從蟾蜍中分離而得到的腎上腺素、嗎啡、多糖類和蝶啶類等化合物〔2〕。近幾年來臨床醫學和藥學的進一步研究表明蟾酥還具有抗腫瘤、抗老年癡呆、降血壓、抗炎和麻醉等多種藥理學作用〔3〕。在PLGA中將蟾蜍的提取物包裹于其中而制備成微球。這種微球是具有長效作用機制的貯庫式的可生物降解的微球，不僅能夠明顯地提高患者的耐受性和依從性，同時也能夠提高藥物的生物利用度和生物學穩定性。

1 資料與方法

1.1 材料 蟾酥購于吉林大藥房(經吉林大學藥學院鑒定為蟾酥Bufobufo gargarizans C antor)。蟾毒靈對照品，華蟾毒配基對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)。RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHIMADZU LC-10AVP高效液相色譜儀(日本)，AB204-N電子天平(Mettler公司)。所用化學試劑均為分析純(北京化學試劑廠)。

1.2 方法

1.2.1 采用復乳溶劑揮發法制備蟾酥提取物蟾毒靈和華蟾毒配基微球 精密稱取蟾酥提取物蟾毒靈和華蟾配基200 mg，將其溶于水制備成溶液。向濃度范圍25%～32%的PLGA的二氯甲烷的溶液中，加入濃度為1 200%～1 800%的蟾毒靈和華蟾毒配基的高濃度的水溶液，將其進行高速攪拌從而制成油包水的初乳，向溶有濃度為0.9% ～1.1%的PVA的0℃的水溶液中緩慢注入前述已制備好的初乳。使用自制復乳攪拌反應器進行高轉速攪拌，從而形成水包油包水的復乳。再以低轉速攪拌，利用真空泵在攪拌期間向反應器中進氣，同時在反應器內使用抽風機由內向外排氣，3 h之后即可得到固化的微球。用蒸餾水將所得微球沖洗5次，再使用輔料溶劑(7%甘露醇和1%羧甲基纖維素鈉)將所得微球繼續沖洗2次。微球粉末是微球中加入50 ml的輔料溶劑，再經冷凍干燥而制得。將凍干的微球粉末通過濾網 (154 μm)，在4℃環境中保存。

1.2.2 微球形態學測定及蟾酥提取物蟾毒靈和華蟾毒配基的PLGA微球包封率的測定 將蟾酥的提取物蟾毒靈及華蟾毒配基的PLGA微球 (制備后未加其他輔料)混勻后，在離心管中加入二氯甲烷2 ml以溶解精密稱取的30 mg蟾酥的提取物蟾毒靈和華蟾毒配基的PLGA微球，將管口密封，待二氯甲烷溶解微球后，再將醋酸緩沖液1 ml滴加于管中，將管口密封，在振蕩器上將離心管振蕩10 min，在低速離心機上調整轉速為3 000 r/min，將離心管離心10 min。向另一支試管中加入吸取的上層清液，以及醋酸緩沖液1 ml，將管口密封，將試管在振蕩器上振蕩，再在離心機上離心，吸取上層清液再置于另一試管中。將上述操作重復6次，最后將水加入至試管中定容至6 ml，應用高效液相色譜法檢測需量取70 μl，從而折算包封率。蟾酥的提取物蟾毒靈及華蟾毒配基的微球稱取30 mg以進行粒徑檢測，并通過電鏡及顯微鏡進行形態學的觀察。

1.2.3 色譜條件 為檢測在微球中蟾毒靈和華蟾毒配基的含量，利用高效液相色譜對有機試劑萃取后的溶液進行檢測，ODSC18柱 (250×4.6 mm，5 cm);檢測波長:296 nm;流動相:乙腈∶0.5%磷酸二氫鉀 (KH2PO4)溶液為32∶68(用磷酸調pH3.2);流速為1 ml/min;柱溫:40℃;理論板數按蟾毒靈色譜峰、華蟾毒配基色譜峰計算均不應低于4 000。

1.2.4 制備供試品溶液 取約0.2 g的待測樣品，精密稱定，加入精密量取的40 ml甲醇，將其重量精密稱定，加熱回流2 h，冷卻至室溫，再稱其重量，為補足減失的重量向其中加適量甲醇，混勻。過濾 (0.45 μm微孔濾膜)后，供試品溶液即為其中10 ml的續濾液。分別取供試品溶液、蟾毒靈溶液、華蟾毒配基溶液注入液相色譜儀中，測定、記錄蟾毒靈和華蟾毒配基的保留時間分別為113 min和106 min，理論板數按蟾毒靈峰計算為4 000，按華蟾毒配基峰計算為4 100〔4～6〕。其他峰和蟾毒靈峰、華蟾毒配基峰的分離度 ＞1.5。

2 結果

蟾毒靈和華蟾毒配基的PLGA微球制劑呈粉末狀，白色，微球為致密、圓整的球狀，既無萎縮也無塌陷的現象。其中制備微球粒徑大小適宜，經測量其范圍200 nm～10 μm。微球制劑的包封率較高，該微球制劑的包封率經測量可達70%以上。為滿足肌肉注射的要求其粒徑大小、包封率均符合要求。

為保證峰面積與進樣量呈現良好的線性關系，蟾毒靈的進樣量范圍為0.206～1.03 g。每間隔4 h測定同一供試品溶液一次，分別測定、記錄蟾毒靈與華蟾毒配基的峰面積，再分別計算出兩者的相對標準偏差 (RSD)。數據結果顯示兩者RSD值均不大于3%，符合規定要求。同一批樣品取6份，依前述的方法進行平行試驗，測定結果表明兩者的重現性較好。為考察其穩定性，同一供試品溶液等體積量取6份，分別放置4、8、12、16、20、24 h后進樣，分別測定、記錄蟾毒靈與華蟾毒配基的含量。測定結果顯示兩者的RSD值均不大于3%。穩定性試驗結果表明至少在24 h內供試品溶液性質穩定。

3 討論

目前制備藥物PLGA微球最常用的工藝是復乳攪拌揮發法，由于蟾毒靈與華蟾毒配基兩個蟾酥提取物易溶于水，因此本文制備蟾毒靈與華蟾毒配基的蟾酥提取物微球采用w/o/w的方法。復乳攪拌揮發法的優點是技術路線簡單易行，但是缺點是影響制備工藝的因素較多，其中包括油水的比例、PLGA的濃度、初乳及復乳的速度、內水相的體積以及攪拌裝置等。在蟾酥提取物蟾毒靈與華蟾毒配基微球的制備中諾華制藥采用的是噴霧干燥法。干燥法制備的微球優點是均一性良好，能夠一步成球，微球無需再進行后處理，適合較大規模的工業生產;然而經復乳攪拌揮發法制備的蟾毒靈和華蟾毒配基的蟾酥提取物微球的優勢體現在藥物的釋放上。將工藝參數控制好，并保證操作無菌，復乳攪拌揮發法同樣能夠放大生產。

由于蟾酥中成分的組成及結構復雜，迄今為止對蟾酥中包含的所有成分尚未研究明確，現有研究成果顯示蟾酥中約20%是脂溶性成分，其中主要為蟾蜍毒素類包括蟾毒配基類及其酯〔7〕。蟾毒配基類 (bu fogeinins)一般是蟾蜍毒素類化合物等原成分經過提取或者干燥加工過程分解而得到的，其原因可能是蟾蜍毒素在蟾酥的炮制及加工過程中分解而成。蟾毒配基類的種類約有20多種，其中主要包括華蟾毒配基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、遠華蟾毒精、日蟾毒它靈、蟾毒它靈等化合物。隨著對蟾酥的臨床作用、藥理學及藥效學研究的不斷深入，眾多學者日益重視和研究提取分離蟾酥中的有效成分。本文系統地研究了蟾毒靈和華蟾毒配基這兩個的蟾酥中有效成分的含量，并為緩控釋制劑的應用而制備相應的微球，為蟾酥中有效成分蟾毒靈和華蟾毒配基在微球制劑的檢測以及蟾酥在臨床應用、藥理學和藥效學等方面的研究提供了新的實驗依據，并為研制和開發蟾酥相關的緩控釋制劑提供了實驗和理論基礎。

1 蘇永華，牛 欣.蟾酥制劑的藥效作用研究評述〔J〕.北京中醫藥大學學報，2001;24(2):51-4.

2 劉 冬，杜守穎，何秀峰，等.蟾酥中3種脂溶性有效成分提取工藝及含量測定方法〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2011;17(3):69-72.

3 曹徐濤.蟾皮的化學成分研究〔D〕.沈陽藥科大學碩士論文，2009;10(S1).

4 劉 丹，奉建芳.蟾酥中3種蟾毒配基組合物的表觀溶解度和表觀油水分配系數的測定〔J〕.中國中藥雜志，2008;33(11):1256-8.

5 鈕亞珍，薛貴平.蟾酥的藥理作用研究進展〔J〕.張家口醫學院學報，2002;19(3):58-9.

6 王浩天，王 爽，王海龍.蟾酥提取物華蟾毒配基和蟾毒靈含量測定〔J〕.人參研究，2008;1:29-31.

7 劉吉華，王靜蓉，余伯陽.反相高效液相色譜法測定蟾酥中的3種蟾毒內酯〔J〕.色譜，2008;26(2):186-8.