雷公藤內酯醇對β-淀粉樣蛋白誘導的大鼠小膠質細胞IL-1β和PGE2表達的影響

李耀斌 聶 菁 呂 誠 胡小令 薛國勇 魯純糾 (南昌大學醫學院解剖學教研室，江西 南昌 330006)

多數學者認為阿爾茨海默病 (AD)與 β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積激活小膠質細胞引起的炎癥反應和神經毒性作用有關。激活的小膠質細胞分泌多種炎性介質參與AD病理過程，其中白細胞介素-1β(IL-1β)和前列腺素E2(PGE2)在這一過程起重要作用〔1～3〕。雷公藤內酯醇是雷公藤中的主要有效成分之一，具有顯著的抗炎、免疫調節作用，可通過抑制免疫細胞中炎性因子的表達而發揮其藥理作用〔4〕。故本實驗擬用Aβ1-40誘導體外培養的原代小膠質細胞，建立AD細胞模型，并在此基礎上給予不同劑量中藥免疫抑制劑雷公藤內酯醇進行干預，觀察藥物對IL-1β和PGE2表達的影響，探討雷公藤對AD的可能作用機制，為臨床尋找防治AD的有效中藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生24 h SD大鼠，購自江西中醫學院實驗動物中心。

1.1.2 試劑 DMEM/F12(1∶1)培養基、特優級新生小牛血清、胰蛋白酶均為Invitrogen公司產品;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產品;鹽酸利多卡因 (10 ml注射液，有效含量0.2 g，分子量288.82);雷公藤內酯醇、Aβ1-40均為Sigma公司產品;小鼠抗CD11b/c抗體 (CBL1512Z克隆號OX-42)為美國Chemicon International公司產品，人P物質(SP)免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺 (DAB)顯色試劑盒和多聚L-賴氨酸為北京中杉公司產品;IL-1β、PGE2放射免疫試劑盒均為北京華英公司產品。

1.2 方法

1.2.1 小膠質細胞純化培養 按已有的小膠質細胞原代培養方法〔5〕，采取24 h內出生的SD乳鼠無菌條件下開顱取腦，仔細剝離血管和軟腦膜，磷酸鹽緩沖液 (PBS，0.01 mol/L)沖洗數次后剪碎，過200目細胞篩后離心棄上清，培養9 d左右，細胞充分分層生長后，加入鹽酸利多卡因溶液(12 mmol/L)，37℃ 5%CO2培養箱中培養5 min，輕搖培養板2 min，鏡下觀察，待大量細胞懸浮后，收集細胞懸液，離心 (1 000 r/min 5 min)收集細胞，種植于6孔培養板，30 min后換液1次，去除未貼壁的細胞。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養基繼續培養。2～3 d換液1次，6 d后采用免疫細胞化學染色對小膠質細胞進行鑒定。

1.2.2 免疫細胞化學染色 取出培養中的蓋玻片，經0.01 mol/L PBS洗滌細胞3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌細胞5 min 3次，3%H2O2去離子水孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，滴加封閉用正常山羊血清工作液室溫孵育5 min，傾去，勿洗，滴加一抗CD11b/c(1∶100)，4℃ 過夜;PBS沖洗3 min 3次;滴加生物素標記山羊抗小鼠IgG二抗工作液37℃ 10～15 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液 37℃ 10～15 min，PBS沖洗，3 min×3次，DAB顯色劑顯色，脫水，透明，封片，鏡下觀察攝片。以PBS(0.01 mol/L)緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.2.3 Aβ1-40制備 將Aβ1-40溶于滅菌后的生理鹽水，37℃孵育7 d，使其變成凝聚態的Aβ1-40液備用。

1.2.4 細胞分組與藥物干預 小膠質細胞按1×105/cm2細胞密度接種于24孔培養板 (預先放置多聚賴氨酸處理過的蓋玻片，每孔0.5 ml)分為4組 (每組8孔):5 μg/ml組加入終濃度為20 μg/ml的Aβ1-40和終濃度為5 μg/ml的雷公藤內酯醇，25 μg/ml組加入終濃度為 20 μg/ml的 Aβ1-40和終濃度為25 μg/ml的雷公藤內酯醇，模型組加入終濃度為20 μg/ml的Aβ1-40，對照組不處理。

1.2.5 IL-1β和 PGE2含量的檢測 各組細胞培養2、12、24 h后取上清于－20℃凍存;細胞培養上清液參照產品說明書用放射免疫法檢測IL-1β和PGE2的含量。

1.3 統計學處理 應用SPSS10.0統計軟件進行分析，數據資料以±s表示，采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 Aβ1-40可誘導大鼠小膠質細胞IL-1β及PGE2表達上調20 μg/ml的Aβ1-40與大鼠小膠質細胞共孵育2、12、24 h后，分別提取細胞上清液，用放射免疫學的方法檢測IL-1β及PGE2的含量。Aβ1-40可以誘導小膠質細胞IL-1β表達明顯上調，而且在12 h達到高峰，上調率達44.9%，與對照組相比較有顯著性差異 (P＜0.01);在24 h后逐漸降低，上調率仍可達18.7%，與對照組比較仍有顯著性差異 (P＜0.05)。Aβ1-40在12 h可以誘導小膠質細胞PGE2表達明顯上調，上調率達19%，與對照組相比較有顯著性差異 (P＜0.01)。見圖1。

圖1 不同Aβ1-40與大鼠小膠質細胞共孵育時間下Aβ1-40對小膠質細胞IL-1β、PGE2表達的影響

2.2 雷公藤內酯醇可抑制Aβ1-40誘導的小膠質細胞IL-1β、PGE2表達 用 5、25 μg/ml的雷公藤內酯醇、20 μg/ml的Aβ1-40與大鼠小膠質細胞共孵育2、12、24 h后，分別提取細胞上清液，用放射免疫學的方法檢測IL-1β、PGE2含量。當加入雷公藤內酯醇后可以抑制其 IL-1β的表達上調，尤其是在25 μg/ml、12 h 作用最強，IL-1β 表達下調了 36.6%，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。5 μg/ml的雷公藤內酯醇在12 h可以抑制其PGE2的表達上調，PGE2表達下調了17.3%，與模型組相比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 不同濃度的雷公藤內酯醇對細胞上清液中IL-1β、PGE2表達的影響(± s，n=8)

表1 不同濃度的雷公藤內酯醇對細胞上清液中IL-1β、PGE2表達的影響(± s，n=8)

與對照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型組比較:3)P ＜0.01，4)P ＜0.01;與5 μg/ml組比較:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01

組別 IL-1β 2 h 12 h 24 h PGE2 2 h 12 h 24 h對照組 0.409 00±0.052 12 0.430 67±0.017 04 0.514 67±0.049 03 20.319±1.216 16.656±0.619 17.558±1.358模型組 0.538 67±0.024 832)0.624 00±0.007 002)0.611 00±0.076 181) 18.057±1.0361) 19.875±1.8112) 15.958±0.069 5 μg/ml組 0.599 00±0.010 152)0.485 67±0.062 853)0.273 00±0.041 152)3) 19.885±0.462 16.434±2.3944) 16.899±0.204 25 μg/ml組 0.554 00±0.057 302)0.395 33±0.091 743)5)0.447 00±0.010 03)6)17.331±1.8842)5) 19.594±1.5971)6) 18.176±0.1723)

3 討論

McGeer等〔6〕根據病理學、流行病學調查資料首先提出了AD的免疫炎癥學說，Aβ沉積激活小膠質細胞是其核心病理機制。近年來，該學說在AD發病中的作用已經被廣泛重視。一般認為Aβ刺激小膠質細胞產生IL-1β是炎癥反應的始動環節，IL-1β通過自分泌途徑促進小膠質細胞的增殖和活化，啟動IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1等細胞因子的釋放，誘導補體、趨化因子和黏附分子的產生增加。這些免疫炎性因子反過來又激活小膠質細胞，在體內形成正反饋環路，產生炎癥反應的級聯放大效應，最終導致神經細胞變性壞死〔7〕。PG是花生四烯酸的代謝產物之一，普遍存在于體內各組織中。PGE2作為其中一個主要的炎癥介導因子，不僅具有多種生理功能，而且在AD的炎性病理過程中也起到了重要的作用〔8〕，PGE2可刺激離體的重組人促紅素 (CHO細胞)Aβ的表達上調，其機制可能是通過激活PGE2受體進而提高細胞水平上的 cAMP來實現的〔9，10〕。去除 PGE2受體，可以減少AD模型鼠中的氧化刺激炎性反應以及老年斑中Aβ的沉積〔11〕。以上提示PGE2在AD的發生發展中起重要的作用，但是其作用的具體機制尚存在爭議，這可能與PGE2的受體存在著四個亞型，而各亞型在信號轉導、組織定位和表達調控各有差異有關〔8〕。另外，流行病學的調查發現在腦脊液中PGE2含量高的患者中僅有輕度的記憶障礙，但在低PGE2含量的患者中癥狀卻更為嚴重〔12〕。本實驗在細胞水平上證實了Aβ在12 h可以激活小膠質細胞IL-1β和PGE2的表達到高峰，進一步支持了AD的免疫炎癥學說。

雷公藤內酯醇是從雷公藤中分離出的活性最高的環氧化二萜內酯化合物，有較強的抗炎及免疫抑制活性，在臨床上已得到廣泛應用。本文前期工作表明，雷公藤內酯醇可以抑制Aβ誘導的AD動物模型海馬核因子-κB的活化和IL-1β的表達，改善其學習記憶能力〔13，14〕。本實驗進一步觀察雷公藤內酯醇對Aβ誘導的AD細胞模型炎性介質表達的影響，結果顯示，加藥的兩組小膠質細胞IL-1β和PGE2的表達在12 h較模型組明顯降低，表明雷公藤內酯醇能抑制AD細胞模型IL-1β和PGE2的表達。因此認為，雷公藤內酯醇有可能通過抑制Aβ介導的小膠質細胞活化，減少細胞因子等炎癥介質的分泌，從而減輕炎性反應，達到減輕神經元損傷、改善大鼠學習記憶能力的目的。但對于其確切的作用機制尚需進一步探討。

1 Krause DL，Müller N.Neuroinflammation，microglia and implications for anti-inflammatory treatment in Alzheimer's disease〔J〕.Int J Alzheimers Dis，2010;10:4061.

2 Heneka MT，O'Banion MK.Inflammatory processes in Alzheimer's disease〔J〕.J Neuroimmunol，2007;184(1-2):69-91.

3 Rogers J.The inflammatory response in Alzheimer's disease〔J〕.J Periodontol，2008;79(8):1535-43.

4 趙 湘，孫建實，金李君，等.雷公藤內酯醇作用機制研究進展〔J〕.中國中醫藥科技，2006;13(3):200-4.

5 趙 虎，朱長庚，魏 瑛，等.小膠質細胞純化分離培養方法的改良〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2007;16(1):115-21.

6 McGeer PL，Rogers J，McGeer EG.Neuroimmune mechanisms in Alzheimer disease pathogenesis〔J〕.Alzheimer Dis Assoc Disord，1994;8(3):149-58.

7 Lue LF，Kuo YM，Beach T，et al.Microglia activation and anti-inflammatory regulation in Alzheimer's disease〔J〕.Mol Neurobiol，2010;41(2-3):115-28.

8 Wei LL，Shen YD，Zhang YC，et al.Roles of the prostaglandin E2 receptors EP subtypes in Alzheimer's disease〔J〕.Neurosci Bull，2010;26(1):77-84.

9 Hoshino T，Nakaya T，Homan T，et al.Involvement of prostaglandin E2 in production of amyloid-beta peptides both in vitro and in vivo〔J〕.J Biol Chem，2007;282(45):32676-88.

10 Hoshino T，Namba T，Takehara M，et al.Prostaglandin E2 stimulates the production of amyloid-beta peptides through internalization of the EP4 receptor〔J〕.J Biol Chem，2009;284(27):18493-502.

11 Liang X，Wang Q，Hand T，et al.Deletion of the prostaglandin E2 EP2 receptor reduces oxidative damage and amyloid burden in a model of Alzheimer's disease〔J〕.J Neurosci，2005;25(44):10180-7.

12 Combrinck M，Williams J，De Berardinis MA，et al.Levels of CSF prostaglandin E2，cognitive decline，and survival in Alzheimer's disease〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006;77(1):85-8.

13 呂 誠，胡小令，萬 斌，等.雷公藤內酯醇對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶和海馬核因子-κB表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(17):2186-8.

14 呂 誠，胡小令，楊寶林，等.雷公藤內酯醇對阿爾茨海默病模型大鼠海馬白細胞介素-1β mRNA和蛋白表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(9):1227-9.