甘草酸對氧化應激、細胞凋亡的影響及其對糖尿病腎病大鼠的療效

劉長山 王秀軍 孫麗萍 柳 林 明 義 劉海霞 (濰坊市人民醫院內分泌科，山東 濰坊 261041)

糖尿病腎病(DN)的發生、發展和嚴重程度與高血糖升高程度及持續時間密切相關〔1〕，高血糖導致的氧化應激是DN的重要發病機制。近年來許多研究發現細胞凋亡參與了DN發生的整個過程，但氧化應激與細胞凋亡的關系研究資料不多。本研究對糖尿病大鼠模型測定組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，觀察腎臟細胞凋亡形態學改變及凋亡相關蛋白的表達，并予以抗氧化劑α-硫辛酸和具有抗氧化作用的中藥甘草酸進行干預治療，以研究氧化應激與細胞凋亡的關系，探討抗氧化劑防止細胞凋亡進而防治DN可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性6周齡Wistar大鼠，體重180～200 g，由山東大學實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國 Alexi公司。α-硫辛酸購自德國史達德藥廠(批號:81526)。甘草酸購自南京正大天晴制藥有限公司(批號:國藥準字H20051942)。DL-甘油醛購自美國Sigma公司。NADPH購自美國Roche公司。bcl-2、bax免疫組化測定藥盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。H-7500透射電鏡，日本HITACHI公司。UV-260型分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 適應性喂養大鼠1 w后，隨機取10只作為正常對照組喂養常規飼料，其余30只擬作為糖尿病觀察組。于左下腹腔按60 mg/kg體重注射STZ溶液，注射后72 h斷尾用羅氏血糖儀測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型建立。將30只模型大鼠隨機分為糖尿病模型組、α-硫辛酸治療組和甘草酸治療組，每組10只，各組間血糖值無差異。每日灌胃給藥，α-硫辛酸組 10 mg·kg－1·d－1，甘草酸組 30 mg·kg－1·d－1，糖尿病模型組和正常對照組則用等容量生理鹽水1 ml/100 g/d。于實驗的第 4，8，12，16 周測定血糖，16 w 時處死大鼠。期間大鼠死亡1只，共有39只大鼠完成全部實驗研究。用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。取右腎組織放于4%中性甲醛中固定，進行HE染色及免疫組化染色。取左腎少量皮質，切成約1 cm3左右小塊，放入3%戊二醛固定，進行電鏡觀察。取左腎剩余皮質稱重，置于-70℃冰箱保存，進行丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定。腎臟病理觀察采用常規HE染色。

1.2.2 bcl-2、bax蛋白免疫組織化學染色 常規石蠟切片，透明、復水，按1∶100比例稀釋的小鼠抗大鼠bax和bcl-2抗體，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根過氧化物酶標記的卵白素工作液，DAB顯色。

1.2.3 腎組織透射電鏡超微結構觀察 將組織切成1 mm3左右的小塊，用3%戊二醛固定。1%鋨酸后固定，Epon812包埋。在透射電鏡下觀察。

2 結果

2.1 實驗前后大鼠體重與血糖變化 藥物干預試驗前各糖尿病大鼠體重與正常對照組均無明顯差異(P＞0.05)，血糖均顯著高于正常對照組(P＜0.01)，治療16 w結束時，糖尿病各組大鼠體重明顯低于正常對照組(P＜0.01)，兩治療組血糖與治療前比較無顯著差異(P＞0.05)，糖尿病各組間體重無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重和血糖比較(±s)

表1 各組大鼠體重和血糖比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01

組別 n 體重(g)實驗前 實驗16 w后血糖(mmol/L)實驗前 實驗16 w后正常對照組 10 272.2±12.3 505.4±55.6 7.13±1.02 7.52±0.90糖尿病模型組 9 272.8±14.5 315.5±24.31)21.39±8.281)22.66±7.43 α-硫辛酸組 10 274.7±11.1 297.1±24.21)21.68±7.591)23.37±8.38甘草酸組 10 274.6±10.9 298.0±25.41)21.12±7.461)23.12±8.01

2.2 α-硫辛酸、甘草酸對糖尿病大鼠腎臟MDA、SOD的影響

與正常對照組比較，糖尿病各組大鼠腎組織勻漿MDA水平顯著升高(P＜0.01)，SOD降低(P＜0.01);α-硫辛酸治療組、甘草酸治療組與糖尿病模型組比較，MDA水平降低(P＜0.05)，SOD升高(P＜0.01)，兩治療組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 大鼠腎臟丙二醛、超氧化物歧化酶水平比較(±s)

表2 大鼠腎臟丙二醛、超氧化物歧化酶水平比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與糖尿病模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 n SOD(nU/mg) MDA(nmol/mg prot)正常對照組10 5.66±44.94 2.66±0.61糖尿病模型組 9 4.69±26.231) 4.30±0.391)α-硫辛酸治療組 10 5.38±21.741)3) 3.08±0.281)2)甘草酸治療組 10 5.25±18.731)3) 2.99±0.201)2)

2.3 腎臟病理學觀察 光鏡下見正常對照組大鼠腎小球毛細血管形態及分布無異常，糖尿病模型組見腎小球毛細血管充血、擴張，腎小球明顯增大，腎小球系膜區擴張和基膜不同程度增厚，腎小球細胞數目減少，腎小球細胞外基質明顯增多，系膜區擴大。而各糖尿病治療組腎小球增大不明顯，腎小球系膜細胞和系膜基質輕度增生，較糖尿病模型組病變明顯減輕。

2.4 bcl-2蛋白表達結果 bcl-2蛋白主要位于腎小管，在細胞質和細胞膜表達。正常對照組大鼠腎臟bcl-2蛋白明顯表達，糖尿病模型組腎小管bcl-2蛋白表達減少，而兩糖尿病治療組Bcl-2蛋白表達較糖尿病模型組組增多。

2.5 bax蛋白表達結果 bax蛋白在腎小球、腎小管均有表達，表達在胞漿內。正常對照組表達較弱，糖尿病模型組蛋白表達明顯增多，而治療組蛋白表達較糖尿病模型組減少。

2.6 透射電子顯微鏡細胞凋亡觀察 電鏡下可見正常大鼠腎小管上皮細胞有微絨毛，細胞胞膜完整，細胞器豐富，基底膜質膜內褶，線粒體良好，無線粒體腫脹。糖尿病模型組大鼠腎組織系膜細胞核內染色質趨邊濃縮、聚集、細胞核周間隙增寬，線粒體明顯腫脹，細胞質吞飲泡大量增多，上皮細胞內見凋亡小體。腎小管上皮細胞核固縮，核染色質邊集。糖尿病治療組大鼠腎組織細胞核固縮、染色質趨邊減輕線粒體腫脹不明顯。

3 討論

細胞凋亡在DN的發生與發展中起著重要作用，糖尿病高血糖狀態下的代謝紊亂使細胞凋亡增加是發生DN的重要原因，多種病理類型腎病的發生發展及損傷后的修復過程均伴隨著細胞凋亡參與〔2〕。

高血糖通過何種途徑導致細胞凋亡的機制尚不完全清楚，有研究提示，高血糖導致氧化應激與細胞凋亡密切相關，當外源性活性氧及細胞內ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力減弱時可致細胞凋亡，機制:活性氧誘導NF-κB表達;氧化應激誘導的與凋亡相關的基因除了與bcl-2有關外，c-Myc和Fas-FasL也參與氧化應激誘導的細胞凋亡〔3，4〕。

本實驗中我們發現，糖尿病時，高血糖通過增加腎臟氧化應激而調節凋亡相關基因bcl-2和bax的表達，誘導腎小管、腎小球細胞凋亡而參與DN的發生發展。抗氧化治療對DN的病理損害有明顯的保護作用。

甘草酸是甘草中的主要活性成分，為甘草甜素類化合物，具有廣泛的生理及藥理作用，如抗炎癥、免疫抑制、抗氧化、抑制血小板聚集，降血脂與抗動脈粥樣硬化等〔5〕。本研究發現甘草酸具有明顯抗氧化的作用，其作用效果與典型抗氧化劑α-硫辛酸相近，可改善DN動物模型腎臟病理變化及細胞凋亡，可見，中藥甘草酸在防治DN中有較好的臨床應用前景。

1 DCCT:TheDiabetesControland ComplicationsTrialResearch Group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.N Engl J Med，1993;329(14):977-86.

2 Sano K，Fujigaki Y，Miyaji T，et al.Role of apoptosis in uranyl acetateinduced acute renal failure and acquired resistance to uranyl acetate〔J〕.Kidney Int.2000;57(4):1560-70.

3 Collins M，Rivas A.The control of apoptosis in mammalian cells〔J〕.Trends Biochem Sci，1993;18(8):307-9.

4 Kamimoto Y，Sugiyama T，Kihira T，et al.Transgenic mice overproducing human thioredoxin-1，an antioxidative and anti-apoptotic protein，prevents diabetic embryopathy〔J〕.Diabetologia，2010;53(9):2046-55.

5 李開龍，張建國，王慧民，等.甘草酸18α體對梗阻性腎病大鼠腎間質中NF-κB表達的影響〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2004;20(1):31-3.