慢性間斷性缺氧對帕金森病模型小鼠紋狀體氧化應(yīng)激的影響

張子彥 徐江濤 宋永斌 楊 俊 許永華 余伍忠 劉海林 李景春

(新疆醫(yī)科大學(xué)研究生院，新疆 烏魯木齊 830001)

帕金森病(PD)是以震顫、肌強直、運動減少和姿勢異常為特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，多發(fā)生于中老年人。病理上以選擇性中腦黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元喪失、紋狀體DA含量顯著減少為其特點。氧化應(yīng)激反應(yīng)是PD的發(fā)病機制之一〔1〕。PD易導(dǎo)致氣道及肺部異常，從而增加患睡眠呼吸暫停綜合征(SAS)的風(fēng)險〔2〕。SAS主要病理生理改變是慢性間斷性缺氧(CIH)〔3〕。其特征性缺氧在氧合過程中可產(chǎn)生大量氧自由基，使全身多個器官產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，腦組織易受到自由基的攻擊而發(fā)生變性〔4〕。我們已在前期實驗中觀察到CIH可加重PD模型小鼠行為學(xué)異常并使紋狀體DA含量顯著減少和中腦黑質(zhì)的病理損害〔5，6〕，本實驗主要觀察CIH對百草枯(PQ)致PD小鼠模型紋狀體的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 自制間斷缺氧箱和對照箱;雙光束UV-8500型分光光度計(上海天美科技儀器有限公司);高效液相色譜儀(日本島津);色譜柱(Waters Symmetry shield TM RP 18)。PQ(美國Sigma公司);DA標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所);超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、考馬斯亮藍蛋白濃度檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。

1.2 實驗動物與分組 6周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠，體重18～22 g(新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心);將44只小鼠隨機分為4組，每組11只。①PQ組:參照文獻〔6〕方法制作PD模型，按照0.025 ml/g體重腹腔注射0.4 mg/ml PQ溶液，每周2次，連續(xù)6 w，后4 w放入對照箱，每天8 h(10:00～18:00)，觀察小鼠行為變化。根據(jù)小鼠是否出現(xiàn)特征性PD表現(xiàn)判斷模型成功與否。②CIH組:腹腔注射生理鹽水0.025 ml/g體重，每周2次，連續(xù)6 w，后4 w按文獻〔6〕方法給予CIH處理，將實驗箱密閉時小鼠呼吸箱內(nèi)有限的氧氣造成低氧，然后實驗箱開啟，室內(nèi)空氣迅速進入箱內(nèi)形成復(fù)氧，每次循環(huán)150 s:關(guān)閉120 s，開啟30 s，每天8 h(10:00～18:00)。③PQ+CIH組:建立 PQ誘導(dǎo)的PD模型，同時后4 w給予CIH處理;④對照組:腹腔注射生理鹽水0.025 ml/g體重，每周2次，連續(xù)6 w。后4 w放入對照箱，每天8 h(10:00～18:00)。

1.3 小鼠行為學(xué)評價 觀察小鼠自主活動行為，經(jīng)PQ處理出現(xiàn)活動明顯減少、爬行較緩慢、反應(yīng)遲鈍、弓背狀姿勢、不自主豎毛、并有輕微震顫等PD自發(fā)特征性表現(xiàn)即造模成功。

1.4 紋狀體DA含量，SOD和GSH-Px活性、GSH和MDA含量測定

1.4.1 紋狀體的取材 試驗終點將小鼠斷頭取腦標(biāo)本，將小鼠腦組織迅速于冰皿上取出紋狀體部分，－80℃保存。

1.4.2 DA含量測定 將小鼠紋狀體稱重，加5倍量0.1 mol/L高氯酸制成勻漿。置于低溫離心機10 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液進行色譜分析。色譜條件為:高效液相色譜儀;色譜柱;流動相甲醇;0.05 mol磷酸氫二鈉;0.02 mol檸檬酸(2∶72∶24)，pH=6.0;流速為 1.0 ml/min，檢測波長280 nm，柱溫 30℃;進樣量:20 μl。

1.4.3 SOD和GSH-Px活性以及GSH和MDA含量測定 測定方法按南京建成生物工程有限公司的試劑盒方法檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 動物的行為表現(xiàn) 小鼠在經(jīng)PQ處理4 w時自發(fā)性活動減少，6 w時小鼠的活動明顯減少、爬行較緩慢、反應(yīng)遲鈍、弓背狀姿勢和不自主豎毛，并有輕微震顫等PD特征性表現(xiàn)。

2.2 各組間紋狀體DA含量比較 CIH組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.10)，PQ組和PQ+CIH組與對照組及CIH組比較均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，PQ+CIH組與PQ組比較則明顯減少(P=0.000)。見表1。

2.3 各組間紋狀體SOD和GSH-Px活性，GSH和MDA含量比較 PQ組、CIH組和PQ+CIH組分別與對照組比較，紋狀體SOD和GSH-Px活性顯著降低，GSH含量亦顯著降低，MDA含量顯著增高(P＜0.05);PQ+CIH組與PQ組和CIH組比較，紋狀體SOD和GSH-Px活性顯著降低，GSH含量亦顯著降低，MDA含量顯著增高(P＜0.01);PQ組與CIH組比較，SOD和GSH-Px活性以及GSH和MDA含量無差異。見表1。

表1 小鼠紋狀體DA含量及SOD和GSH-Px活力，GSH和MDA含量的比較(± s，n=44)

表1 小鼠紋狀體DA含量及SOD和GSH-Px活力，GSH和MDA含量的比較(± s，n=44)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與PQ組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與CIH組比較:5)P＜0.01

組別 DA(μg/g) SOD(U/ml) GSH-Px(U/gprot) GSH(mg/gprot) MDA(nmol/mgprot)對照組 15.32±1.00 63.01±2.56 55.68±5.10 16.60±1.622.97±0.38 PQ組 12.45±1.082) 59.35±3.202) 50.07±5.612) 13.82±1.082) 3.90±0.832)CIH組 14.65±0.83 60.37±3.371) 51.95±3.951) 14.50±1.22) 3.41±0.581)PQ+CIH組 10.68±0.742)4)5) 55.51±2.922)4)5) 46.20±2.592)3)5) 12.52±0.732)3)5) 4.57±0.862)3)5)

3 討論

PQ 與神經(jīng)毒素 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahy-dropyridine，MPTP)的活性代謝產(chǎn)物 1-甲基-4-苯基-四氫吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydro-pyridine，MPP+)極為相似，能夠透過血腦屏障，作用于多巴胺能神經(jīng)元，致使其發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而使黑質(zhì)紋狀體部位活性氧(ROS)清除減少，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，最終造成多巴胺能神經(jīng)元的凋亡〔7〕。本實驗中，給予PQ注射的小鼠均出現(xiàn)PD特征性表現(xiàn)、紋狀體內(nèi)DA含量減少，且紋狀體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，說明造模成功。CIH可引起全身氧化應(yīng)激反應(yīng)。目前證實在發(fā)生間斷性缺氧時，可使SOD生成不足，活性降低，致使組織氧自由基清除減少，從而發(fā)生氧化應(yīng)激〔8〕。本實驗中，我們通過對PD模型鼠進行CIH處理，發(fā)現(xiàn)小鼠紋狀體亦有氧化應(yīng)激反應(yīng)增強。但單獨CIH處理并未引起紋狀體DA含量降低，PD模型給予CIH處理后可見紋狀體氧化應(yīng)激反應(yīng)進一步增強，DA含量較之單純PQ組進一步下降。

腦組織是機體氧化代謝最活躍的器官，且含有大量易氧化的不飽和脂肪酸;但腦組織內(nèi)抗氧化相關(guān)酶的活性及抗氧化小分子谷胱甘肽的含量較低;特別是在紋狀體和黑質(zhì)內(nèi)含有大量的多巴胺，多巴胺在自發(fā)的或經(jīng)酶催化的代謝過程中產(chǎn)生氧自由基、過氧化氫等神經(jīng)毒性物質(zhì)〔9〕。PQ使DA能神經(jīng)元煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)耗竭和氧化應(yīng)激ROS的產(chǎn)生，NADPH減少使氧化型谷胱甘肽(GSSG)不能由谷胱甘肽還原酶催化還原為GSH，從而導(dǎo)致紋狀體部位ROS清除減少，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，最終造成DA能神經(jīng)元的凋亡〔10〕。CIH可使線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ、Ⅳ耗氧量下降，過氧化物等氧化應(yīng)激相關(guān)指數(shù)在電子傳遞到線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ時增加〔11〕，也使組織內(nèi)ROS含量增加，線粒體不僅是細胞中ROS的主要產(chǎn)生場所，也是對氧化損傷非常敏感的區(qū)域，超過正常水平的ROS，會使線粒體膜電位和線粒體活性急劇降低，導(dǎo)致細胞ATP產(chǎn)生障礙，能量供應(yīng)不足，破壞細胞正常生理功能，導(dǎo)致細胞壞死。同時線粒體也與細胞凋亡緊密相關(guān)，氧化壓力激活線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mtPTP)，從而打開連通線粒體內(nèi)外膜的通道使細胞色素 C、caspase-2，3，9前體、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)以及caspase激活的DNase釋放到細胞質(zhì)中。細胞色素C和胞質(zhì)中的人凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1)結(jié)合激活 caspase，AIF和 caspase激活的DNase轉(zhuǎn)移到細胞核中啟動凋亡〔9〕。PD模型鼠給予CIH處理后，可使紋狀體內(nèi)兩條不同的氧化應(yīng)激通路同時激活，從而產(chǎn)生疊加損害，加劇PD模型小鼠抗自由基損傷的能力。而我們也在前期實驗中觀察到CIH可加重PQ致PD模型小鼠的行為學(xué)、中腦黑質(zhì)的病理損害以及加劇紋狀體DA含量減少〔5，6〕，與上述推論相吻合。

綜上，CIH引起小鼠紋狀體氧化應(yīng)激反應(yīng)，并使PD模型鼠紋狀體氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，同時進一步加重小鼠紋狀體DA含量減少。

1 Rego AC，Oliveira CR.Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis:implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases〔J〕.Neurochem Res，2003;28(10):1563-74.

2 Herer B，Arnulf I，Housset B.Effects of levodopa on pulmonary function in Parkinson's disease〔J〕.Chest，2001;119(2):387-93.

3 Xu W，Chi L，Row BW，et al.Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea〔J〕.Neuroscience，2004;3(2):313-23.

4 David G，Deepti N，Aviv D.Physical activity attenuates intermittent hypoxia-induced spatial learning deficits and oxidative stress〔J〕.Care Med，2010;182(1):1001-8.

5 郭云云，徐江濤，宋永斌，等.慢性間斷性缺氧對帕金森病模型小鼠行為學(xué)及紋狀體多巴胺含量的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2008;8(127):2217-20.

6 李景春，徐江濤，宋永斌，等.慢性間斷性缺氧對帕金森病模型小鼠行為學(xué)及黑質(zhì)病理改變的影響〔J〕.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2010;18(3):231-5.

7 Chun HS，Gibson GE，DeGiorgio LA，et al.Dopaminergic cell death induced by MPP(+)，oxidant and specific neuro toxicants shares the common molecular mechanism〔J〕.Neurochem，2001;76(4):1010-21.

8 Jayasri N，Wang N，Yuan GX，et al.Intermittent hypoxia degrades HIF-2 via calpains resulting in oxidative stress:Implications for recurrent apnea-induced morbidities〔J〕.PNAS，2009;106(4):1199-204.

9 Zhao DL，Zou LB，Lin S，et al.Anti-apoptotic effect of esculin on dopamine-induced cytotoxicity in the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line〔J〕.Neuropharmacology，2007;53(6):724-32.

10 Liu X，Kin CN，Yang J，et al.Induction of apoptotic program in cell-free extracts:requirement for dATP and cytochromec〔J〕.Cell，1996;86(1):147-57.

11 Douglas RM，Ryu J，Kanaan A，et al.Neuronal death during combined intermittent hypoxia/hypercapnia is due to mitochondrial dysfunction〔J〕.Cell Physiol，2010;298(6):1594-602.