CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TGF-β1和IL-10在上皮性卵巢癌中的變化

沈 瑋 田 庚 (吉林省婦幼保健院，吉林 長春 3006)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是健康個體T細(xì)胞庫的組成成分，是一類具有免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞，能抑制T細(xì)胞對外源和自體抗原的免疫反應(yīng)，因此在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止機(jī)體對自體同源腫瘤細(xì)胞的免疫。因此，CD4+CD25+Treg細(xì)胞很可能影響著免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的應(yīng)答，從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。CD4+CD25+Treg細(xì)胞可通過分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10發(fā)揮免疫下調(diào)作用〔1〕。

Brunkow等〔2〕報道，胸腺和外周淋巴組織中自然產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg細(xì)胞可特異表達(dá)一種轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞發(fā)育的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子〔3〕。

本文檢測上皮性卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量及其相關(guān)基因Foxp3 mRNA的表達(dá)以及TGF-β1和IL-10含量的變化，探討CD4+CD25+Treg細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 卵巢癌患者20例(來自吉林大學(xué)第二醫(yī)院)，其中漿液性囊腺癌13例，黏液性囊腺癌7例，年齡28～64〔平均(43.14±9.48)〕歲。非腫瘤患者10例作對照，年齡21～53〔平均(37.4±10.26)〕歲。腫瘤患者術(shù)前未進(jìn)行放、化療，抽取靜脈血2 ml，EDTA抗凝。所有病例均手術(shù)病理確診。

1.2 標(biāo)本采集、處理 EDTA抗凝血2 ml，應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法分離出外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，計數(shù)，取1×106個細(xì)胞標(biāo)記抗CD4-PE單克隆抗體和抗CD25-FITC單克隆抗體進(jìn)行FACS檢測，剩余細(xì)胞加入Trizol試劑后置－80℃冰箱凍存，備RT-PCR檢測。外周靜脈血3 ml，4℃靜置3 h，3 000 r/min離心20 min，分離血清，－70℃儲存以備ELISA檢測使用。重組TGF-β1及IL-10 ELISA試劑盒購自上海森雄公司。

1.3 FACS檢測 熒光抗體標(biāo)記的淋巴細(xì)胞懸液4℃下避光孵育30 min，PBS洗滌，然后進(jìn)行FACS檢測。

1.4 RT-PCR反應(yīng) cDNA的逆轉(zhuǎn)錄采用Takara的AMV RTase，按說明書進(jìn)行操作。通過預(yù)實驗確定PCR反應(yīng)條件和最適循環(huán)數(shù)，以保證PCR產(chǎn)物量與起始cDNA量呈線性相關(guān)。①人Foxp3的引物:正義5'-CTACGCCACGCTCATCCGCTGG-3'和反義:5'-GTAGGGTTGGAACACCTGCTGGG-3'，片段大小為260 bp。②內(nèi)參β-actin引物序列為:正義:5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3';反義:5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3'，片段大小:224 bp。采用Ex Taq DNA聚合酶，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 5 min，隨后進(jìn)行40 次循環(huán)(94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s)，最后72℃延伸10 min。

1.5 RT-PCR產(chǎn)物的檢測 取5 μl PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠，其中含0.5 μg/ml溴乙錠。5 V/cm進(jìn)行電泳，凝膠掃描成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。用Imagemaster VDS(Pharmacia Biotech)圖像分析軟件分析光密度值，以Foxp3/β-actin光密度比值表示Foxp3 mRNA表達(dá)水平，瓊脂糖電泳以100 bp DNA ladder V(鼎國)相對分子質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，實驗各組RT-PCR擴(kuò)增的Foxp3及β-actin條帶與相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)位置相同。

1.6 TGF-β1和IL-10含量的測定 按TGF-β1及IL-10 ELISA試劑盒說明書繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用同一條件下測得的標(biāo)本OD值，實驗組和對照組血清濃度依標(biāo)準(zhǔn)曲線查出，計算濃度時乘以稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血中CD4+CD25+/CD4+T細(xì)胞比例的差異

漿液性囊腺癌患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例〔(23.48±12.23)%〕較非腫瘤病人〔(11.17±7.35)%〕明顯增高(P＜0.05)。黏液性囊腺癌病人外周血CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例〔(21.41±8.91)%〕與非腫瘤病人相比較也明顯增高(P＜0.05)。

2.2 人PBMC中FOXP3 mRNA的表達(dá) 漿液性囊腺癌〔(6.28±1.08)%〕和黏液性囊腺癌〔(5.17±0.95)%〕病人外周血PBMC中Foxp3 mRNA表達(dá)量均明顯高于非腫瘤病人〔(3.43±0.51)%〕(P＜0.05)。

2.3 外周血中TGF-β1、IL-10的含量 漿液性及黏液性囊腺癌患者外周靜脈血中 TGF-β1的含量〔(51.48±12.23)%，(49.41±10.91)%〕較非腫瘤病人〔(18.17±7.35)%〕均明顯增高(P＜0.05)。漿液性及黏液性囊腺癌患者外周靜脈血中IL-10的含量〔(15.83+5.16)%，(16.56+4.24)%〕較非腫瘤病人〔(6.39+2.85)%〕也明顯增高(P＜0.05)。

3 討論

在生理狀態(tài)下，機(jī)體免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視作用防止腫瘤的發(fā)生。然而，研究表明在癌癥患者中免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原常表現(xiàn)為弱的免疫應(yīng)答，從而不能有效清除腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致臨床腫瘤的發(fā)生。這種對腫瘤抗原弱免疫應(yīng)答的原因很可能是由于腫瘤抗原為變化了的自身抗原，因此，維持自身耐受的機(jī)制也在對腫瘤發(fā)揮著耐受作用，使之“逃逸”免疫監(jiān)視。

研究表明，正常情況下機(jī)體內(nèi)Treg的免疫學(xué)意義是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，其作用方式是動態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，有防止免疫反應(yīng)無限制擴(kuò)大及抑制自身免疫反應(yīng)發(fā)生的作用。體內(nèi)Treg的數(shù)量和功能狀態(tài)對機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持有重要意義，理論上Treg數(shù)量過少或功能不足會出現(xiàn)相應(yīng)的免疫性損害，甚至出現(xiàn)自身免疫性疾病。這種情況已在很多疾病中得到證實。但Treg數(shù)量過多或功能過強(qiáng)的情況不多，目前還主要在腫瘤患者上有報道。

CD4+CD25+Treg在機(jī)體內(nèi)維持一定水平，因此在正常人外周血中能夠檢測到Treg表達(dá)，其表達(dá)水平可在一定程度上反映機(jī)體的免疫狀況。但是，即使對于健康成人外周血的Treg水平，目前尚沒有進(jìn)行大規(guī)模普查，不同作者報道的表達(dá)值不盡相同，Dieckmann〔4〕報道 CD4+CD25+T細(xì)胞占 CD4+T細(xì)胞的比例為 2.8% ～17.2%，Ichihara等〔5〕報道為 7.2%，Jonuleit等〔6〕報道0.7% ～5.5%。Baecher-Allan等〔7〕報道為 10%. 這些報道均存在檢測樣本量較少的缺點(diǎn)，其數(shù)值不能代表Treg的正常值，只能說明其大致范圍和相對變動情況。因為Treg可能隨內(nèi)外環(huán)境變化而出現(xiàn)較大范圍的變動。為了解Treg在健康成人的外周血中表達(dá)情況，本文檢測了10例健康成人外周血的Treg表達(dá)率，結(jié)果Treg占CD4+T細(xì)胞的比例為(11.17±7.35)%，與其他研究者報道類似，說明本研究所得結(jié)果基本屬于正常表達(dá)范圍，可以作為深入研究的對照基礎(chǔ)。

大量的實驗證據(jù)表明，由CD4+CD25+Treg細(xì)胞介導(dǎo)的對自身反應(yīng)性細(xì)胞的調(diào)節(jié)也是自身免疫耐受建立的重要機(jī)制之一。因此，可以推測CD4+CD25+Treg細(xì)胞在維持自身耐受的同時，也可以抑制腫瘤免疫的發(fā)生。研究表明，CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以通過不同的機(jī)制抑制不同類型的細(xì)胞參與的腫瘤排斥反應(yīng)。Shimizu〔8〕等證實去除CD4+CD25+Treg細(xì)胞可誘導(dǎo)對同源腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，也可以促進(jìn)腫瘤病變部位的前炎癥反應(yīng)，從而利于誘導(dǎo)對多種腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，證明了CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以抑制體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

Foxp3特異性地表達(dá)于Treg細(xì)胞，可作為Treg細(xì)胞的一個特異標(biāo)志，而且調(diào)節(jié)著該類細(xì)胞的發(fā)育和功能。Foxp3是Treg細(xì)胞發(fā)育的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在人類Foxp3不僅可表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞〔9〕，還可表達(dá)于 CD8+CD28+T細(xì)胞(稱為抑制性T細(xì)胞)〔10〕。表達(dá)Foxp3的T細(xì)胞均具有免疫抑制作用，推測Foxp3的表達(dá)可能是導(dǎo)致這些細(xì)胞發(fā)揮其抑制作用的主要原因。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)漿液性囊腺癌患者和黏液性囊腺癌患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯升高，并且外周血中Foxp3表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明漿液性囊腺癌患者和黏液性囊腺癌患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞不但數(shù)量增加，而且功能增強(qiáng)。因此，有利于腫瘤耐受的形成，降低免疫系統(tǒng)對腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞通過細(xì)胞間接觸發(fā)揮抑制作用，另有研究認(rèn)為該細(xì)胞能分泌免疫下調(diào)性細(xì)胞因子如TGF-β和IL-10等發(fā)揮免疫抑制功能，TGF-β1和 IL-10等細(xì)胞因子對CD4+CD25+Treg細(xì)胞的抑制功能有重要的作用，CD4+CD25+Treg細(xì)胞的接觸依賴抑制作用受 TGF-β1 和 IL-10 調(diào)節(jié)〔11，12〕。IL-10能協(xié)助幼稚T細(xì)胞分化成為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，抑制樹突細(xì)胞表達(dá)協(xié)同分子而間接抑制T細(xì)胞反應(yīng)。而CD4+CD25+Treg細(xì)胞又可分泌IL-10，CD4+CD25+Treg細(xì)胞與IL-10間的正反饋調(diào)節(jié)可能促進(jìn)免疫耐受。TGF-β1也是維持CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和功能的重要因子〔13〕，TGF-β1在體外可以誘導(dǎo)人外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞增生。一般認(rèn)為CD4+CD25+Treg細(xì)胞膜表面結(jié)合的TGF-β1可能是細(xì)胞間相互作用的效應(yīng)分子，抗TGF-β1單克隆抗體能明顯削弱CD4+CD25+Treg細(xì)胞調(diào)控T細(xì)胞的抑制功能。TGF-β1在早期抑制上皮性卵巢癌生長，但在晚期促進(jìn)上皮性卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移〔14〕。TGF-β1和TGF-β3表達(dá)增強(qiáng)以及它們各自受體的缺失能促使腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展，使腫瘤更易復(fù)發(fā)，對化療藥物耐藥。血管生成在卵巢癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中是必不可少的，有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1陽性并伴有VEGF強(qiáng)陽性的血管密度明顯高于TGF-β1陰性、VEGF弱陽性的血管密度。可見TGF-β1與VEGF共表達(dá)能促進(jìn)血管生成，從而有利于血管的生長。

本文證實上皮性卵巢癌患者外周血中免疫抑制性因子TGF-β1和IL-10均較正常對照組明顯增高。表明TGF-β1和IL-10與CD4+CD25+Treg細(xì)胞協(xié)同作用，引起免疫耐受，促進(jìn)上皮性卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移具有重要的作用。綜上所述，CD4+CD25+Treg細(xì)胞是一種重要的具有免疫調(diào)節(jié)作用的T淋巴細(xì)胞，與免疫抑制性因子TGF-β1和IL-10協(xié)同作用，促進(jìn)上皮性卵巢癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。但其作用機(jī)制及CD4+CD25+Treg細(xì)胞與TGF-β1，IL-10的相互影響，還有待深入研究。

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