吉非替尼對臍帶來源間充質干細胞表達MCP-1的抑制作用

王 林 陳 紅 王 原 杜改萍 陳銀蘋 俞亮科 孫曉東

(河北聯合大學附屬醫院藥劑科，河北 唐山 063000)

間充質干細胞(MSCs)廣泛應用于組織工程和細胞治療〔1〕。MSCs還具有免疫調節作用，抑制樹突細胞呈遞抗原，改變單核巨噬細胞的活化狀態，促進調節性T細胞的轉化〔2〕。有研究報道，來源于臍帶組織的MSCs(UC-MSCs)有類似來源于骨髓基質干細胞(BMSCs)的特性〔3〕。而且，臍帶MSCs取材方便，對供者無損傷。表皮生長因子(EGF)是促進MSCs增殖的重要生長因子。有報道發現EGF可促進MSCs向脂肪和骨組織分化，并且可以產生破骨細胞形成促進因子(RANKL)，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等單核巨噬細胞趨化因子，尤其是MCP-1對于單核巨噬細胞的生物學活性有重要的調節作用〔4〕。吉非替尼作為EGF受體的特異性抑制劑已經在臨床中廣為使用，多數癌癥患者從中受益。然而，吉非替尼是否能夠抑制EGF對MSCs的作用，尤其是調節MCP-1表達從而改變單核巨噬細胞的功能活性值得探討。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 UC-MSCs培養方法參照文獻〔3〕。用磷酸鹽緩沖液沖洗臍帶組織樣本，然后用0.075%Ⅰ型膠原酶37℃、30 min消化樣本，然后用含10%胎牛血清的α-MEM培養基中和酶的活性，再將樣本以1 200 r/min，10 min離心10 min，將沉淀物用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養基培養于37℃、5%CO2孵箱。EGF購自R＆D公司。吉非替尼為臨床應用藥物，購自AstraZeneca。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為空白對照組、EGF處理組、吉非替尼處理組、EGF聯合吉非替尼處理組。EGF、吉非替尼作用濃度分別為10 ng/ml、4 μmol/L。聯合組為EGF先作用24 h后再加吉非替尼作用4 h。

1.2.2 Real-Time PCR分析 根據產品說明書，采用TRIzol○RReagent(購自invitrogen公司)提取細胞總RNA并進行逆轉錄。以SYBR Green為高靈敏的DNA熒光染料(購自ABI公司)執行Real-Time PCR分析。分析所用的引物序列為:β-肌動蛋白(β-actin)(對照):5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3'，5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3';MCP-1:5'-GTCCTTCGGGCTCCTTGT-3'，5'-AACTTGCTTCCCGTTCTTCA-3'。

1.2.3 酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 經臺盼藍實驗鑒定用無血清培養基培養UC-MSCs 2 d不影響細胞活力，遂收集上清，并用ELISA試劑盒(R＆D公司)測定上清中MCP-1的濃度。按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 Transwell實驗 分別收集各處理組的UC-MSCs培養上清，置于0.8 μm孔徑的Transwell板(購自Nunc公司)中，于半透膜上層加入1×104單核細胞系RAW264.7(購自美國ATCC)。4 h后于顯微鏡以不同高倍視野(5個高倍視野)下計數細胞每個高倍視野平均細胞數。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，數據資料以±s表示，組間均數比較用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 UC-MSCs中MCP-1表達 空白對照組、EGF組、吉非替尼組、EGF聯合吉非替尼組MCP-1濃度分別為〔(7 632±532)、(1 654±627)、(496±421)、(1 081±723)ng/ml〕，對照組與其余3組比較差異顯著(P＜0.05)，EGF組與EGF聯合吉非替尼組比較差異顯著(P＜0.05)，可見吉非替尼可有效抑制EGF對UC-MSCs表達和刺激MCP-1分泌的作用。

2.2 Transwell實驗結果 空白對照組、EGF組、吉非替尼組、EGF聯合吉非替尼組的單核巨噬細胞數分別為56.0±12.79、160.4±12.24、56.2±9.77、111.4±11.57，EGF組與 EGF聯合吉非替尼組比較差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

本研究證實，EGF可以顯著刺激UC-MSCs分泌MCP-1，這種刺激體現在轉錄水平(實時定量PCR檢測)和蛋白水平(ELISA檢測)。同樣MCP-1分泌變化對單核巨噬細胞的趨化功能有顯著影響。作為EGF的抑制劑，吉非替尼在臨床中廣為應用〔4，5〕。目前主要是針對惡性腫瘤，尤其是特異性高表達生長因子受體的腫瘤，例如肺癌等。作為一種多效應靶點的生長因子，EGF除了能夠刺激腫瘤細胞生長以外，對于機體各種其他成分的組成細胞也都有一定的促增殖作用。研究表明，EGF可以作為MSCs的有效擴增因子，對于干細胞的產業化和臨床應用有重要的意義〔5，6〕。此外，EGF還可以促進 MSCs向骨組織、脂肪組織等分化。近年來注意到EGF可以促進成纖維細胞、間充質細胞和腫瘤細胞產生一些趨化因子，尤其是MCP-1蛋白。作為單核巨噬細胞特異性的趨化因子，MCP-1在誘導單核細胞成熟、趨化以及參與炎癥和腫瘤組織浸潤等生物學效應中發揮著重要的作用〔2，7〕。

前期研究觀察到，EGF可以有效地促進MSCs分泌MCP-1，促進單核巨噬細胞的招募，在腫瘤發展過程中，MSCs可以促進腫瘤轉移和炎癥性單核巨噬細胞浸潤。而本研究發現，給予吉非替尼處理后，EGF對MSCs分泌MCP-1具有抑制作用，這種抑制作用的效果在抑制MSCs招募單核巨噬細胞趨化過程中得以體現，從一個較新的角度提示吉非替尼對EGF受體相關腫瘤浸潤和轉移的抑制作用，為臨床治療腫瘤提供了一種新的思路和探索。

總之，吉非替尼可以有效抑制EGF對UC-MSCs作用，調節MCP-1分泌及其對單核巨噬細胞招募作用。結果不僅提示UC-MSCs與機體免疫細胞的相關性，也為吉非替尼抑制EGF相關腫瘤浸潤移植治療提供新的觀點。

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