硫氧還蛋白和硫氧還蛋白相互作用蛋白與糖尿病腎病關系的研究進展

趙 璇 郭常輝

(重慶醫科大學附屬第二醫院內分泌科，重慶 400010)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，臨床上一旦發生，腎臟損害常呈不可逆進展，透析病人中DN患者占20% ～40%〔1〕，故DN的早期診斷及治療對于改善患者生活質量及預后具有重要的臨床意義。DN的發病機制尚未明了，大量研究表明氧化應激在DN的發病機制中發揮了重要作用。硫氧還蛋白(Trx)及Trx相互作用蛋白(TxnIP)分別參與了氧化應激的對抗及介導。本文就Trx、TxnIP、氧化應激與DN關系做一探討，旨在為DN的發病機制及治療尋求新的突破。

1 Trx

1.1 Trx的生物學特點 Trx是一種小分子蛋白質，分子量約為12 kD，廣泛存在于原核、真核生物中，具有氧化還原活性。它與Trx還原酶(TrxR或TR)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)共同組成一個廣泛分布的NADPH依賴性二硫化物還原酶-Trx系統。該系統都包含有二硫鍵活性位點序列-半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-(-Cys-Gly-Pro-Cys-)。Trx主要分為Trx-1和Trx-2兩型，Trx-l存在于細胞質和細胞核中，Trx-2僅位于線粒體中。Powis等〔2〕通過Western印跡法證實了Trx-2的線粒體定位。目前對Trx-2功能知之甚少，本文中Trx指的是Trx-1。還原型Trx〔Trx-(SH)2〕含有巰基，氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫鍵，后者可被TrxR、NADPH還原。Trx還原作用的機制在于其與底物X-S2結合后，在復合物的疏水環境中，Cys32的巰基作為親核物質，與蛋白底物結合形成共價鍵的二硫化物，最后去質子的Cys35作用于此二硫化物的二硫鍵，釋放出被還原的蛋白底物。

1.2 Trx的生物學功能 Trx的主要生物學功能在于調節細胞內氧化還原狀態，對抗氧化應激。Trx通過多種機制對抗氧化應激，其中主要包括兩個方面〔3〕。一方面，它作為電子載體，為生物合成的催化循環及抗氧化酶類提供氧化還原當量，如核糖核苷酸還原酶，蛋氨酸亞砜還原酶，及過氧化還原蛋白;另一方面，通過細胞內及細胞間的二硫化物的形成，Trx保護細胞質內的蛋白分子防止其聚合或者失活。

另外，Trx的還原形式可抑制凋亡信號調節激酶1(ASK1)的活性，從而抑制ASK1依賴性的凋亡〔4〕。ASK1可激活P38MAP激酶和c-Jun N-端激酶(JNK)通道，是腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導凋亡所必需的分子物質。Trx還具有維持細胞內環境的穩定、修護再灌注損傷、抑癌及細胞因子樣作用。

2 TxnIP

TxnIP〔又稱維生素D3上調蛋白1(VDUP-1)或Trx結合蛋白2(TBP-2)〕，重約50 kD，與抑制類蛋白具有同源性。人們最初在用1，25-二羥維生素D3治療的白血病細胞(HL-60)中發現了TxnIP。此后，人們用酵母雙雜交系統分離了TxnIP，并認為它是Trx結合蛋白，對Trx功能及表達具有負性調節作用，通過抑制Trx系統的功能而發揮介導氧化應激等作用。Patwari等〔5〕證明了TxnIP與Trx通過巰基交換形成穩定的二硫鍵復合物而發生相互作用，并發現了2個對此相互作用十分重要的氨基酸基團-TxnIP63和247位半胱氨酸殘基。

3 TRX和TxnIP與DN的關系

3.1 氧化應激在DN的發展中起了重要作用 近年來研究表明氧化應激在DN的發病機制中起了重要作用。Hamada等〔6〕通過實驗發現糖尿病內環境下腎臟中氧化應激標志物8-脫羥鳥苷(8-OHdG)及acrolein adduct明顯增多，提示氧化應激參與了DN的發生發展。多種機制可誘導細胞內外的氧化應激，包括糖化反應，多元醇途徑，蛋白激酶C依賴的膜性NADPH氧化酶的活化，及線粒體內的電子傳遞，它們介導了不同組織器官細胞功能的紊亂，如腎小球系膜細胞及內皮細胞。為了對抗氧化應激，細胞擁有其自身防御機制如內源性抗氧化劑。在細胞質中，Trx系統及谷胱甘肽/谷氧還蛋白(GSH/GRX)系統對于維持細胞內氧化還原狀態的平衡起了主導作用〔3〕，它們可減少細胞內活性氧(ROS)的產生。已知ROS是細胞內級聯反應調節劑，過多的ROS的產生會導致氧化應激、細胞功能的喪失、甚至細胞的凋亡，且ROS的過多產生與抗氧化應激之間的失衡會導致腎小球系膜細胞脂質代謝的紊亂，引起腎小球系膜細胞的損害〔7〕。

3.2 Trx及TxnIP在腎臟中的定位與表達 Dutta等〔8〕對健康小鼠的腎臟進行Western印跡法分析，結果發現:在腎臟近曲小管細胞中，TxnIP主要分布于細胞核及線粒體中，少量分布于細胞質中，在微粒體中幾乎沒有分布。電鏡下進一步發現，TxnIP存在于腎臟近曲小管細胞的線粒體及細胞核的膜間隙中。Andvani等〔9〕通過實驗研究鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病雌性轉基因R(TGR，mRen-2)27大鼠及DN患者腎臟中TxnIP與Trx的表達及定位。他們利用定量逆轉錄多聚酶鏈反應(QRT-PCR)技術，發現TxnIPmRNA在糖尿病鼠中的表達較健康對照組增多，Trx在糖尿病鼠與非糖尿病鼠中的表達卻無明顯區別;進一步研究發現，TxnIP mRNA在大鼠腎臟的腎小管及遠端腎單位中有大量表達，且TxnIP蛋白的分布與TxnIPmRNA相似;他們在DN患者中得到了與前面所述相同的結果。與TxnIP相比，大鼠腎臟中Trx基因的表達多局限于皮質，內側帶多于外側帶，并在皮質所有結構中均有表達。

3.3 TxnIP與DN 有研究稱〔10〕，高糖環境下TxnIP的表達依賴于轉化生長因子-β1(TGF-β1)對其的上調作用，目前認為TGF-β1為細胞因子網絡的核心，參與了DN腎臟肥大和硬化的發生、發展。然而Qi等〔11〕在高糖環境下培養人類腎臟近曲小管細胞，他們用小分子干擾RNA(siRNA)將TGF-β1基因沉默，發現高糖環境下在TGF-β1基因沉默的近曲小管細胞中，TxnIP及其啟動子的活性仍進一步升高，證明高糖環境誘導TxnIP的升高并非依賴于TGF-β1。

為了探討高糖對腎臟三種不同類型細胞-腎小球系膜(mesangial)細胞、近曲小管細胞及遠曲小管/集合管細胞 TxnIP及Trx基因表達的影響。Advani等〔9〕將三種細胞置于25 mmol/L糖水中培養48 h，與暴露于5.6 mmol/L的糖水中的細胞相比，TxnIP在腎小球近曲小管、遠曲小管及集合管細胞中的表達明顯增加，Trx mRNA在腎小球系膜細胞及遠曲小管/集合管細胞中表達下降，在近曲小管細胞中無明顯影響;胰島素二硫化物還原分析顯示，暴露于高糖環境下48 h后Trx的生物活性下降了;他們又用siRNA沉默TxnIP基因，培養腎小球系膜細胞及近曲小管細胞，發現該環境下高糖對Trx活性的影響減弱了。此實驗揭示了高糖對三種細胞TxnIP及Trx基因表達的影響，進一步證明了TxnIP是Trx活性的負性調節劑。

有研究提示腎小球系膜細胞的病理改變在DN的進展中起關鍵作用。持續的TxnIP超表達可增加高糖及葡糖胺介導的腎小球系膜外基質基因表達及氧化應激，引起腎小球系膜細胞的損害，促進DN的進展。Kobayashi等〔12〕通過實驗發現了TxnIP可導致膠原蛋白在腎小球系膜細胞的沉積。腸促胰島素肽(EX-4)為長效的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑，可以降低TxnIP在胰島β細胞中的水平;Shao等〔13〕研究表明EX-4-cAMP信號通路可導致蛋白酶體依賴性的TxnIP降解，保護DN患者胰島β細胞，促進胰島素分泌，降低其血糖水平，改善腎臟所處的內環境。

Hamada等〔6〕利用STZ誘導的糖尿病大鼠來研究TxnIP在DN發病機制中可能存在的作用。為了評估實驗組與健康對照組大鼠腎臟中氧化應激程度的差別，他們利用酶聯免疫分析方法檢測大鼠腎臟中氧化應激標志物8-OHdG與acrolein adduct的水平，結果顯示，與對照組相比，實驗組中兩種標志物明顯升高;利用QRT-PCR分析發現，實驗組大鼠腎臟中TxnIP mRNA的表達也高于對照組。既然TxnIP可以與Trx相互作用，該實驗證明了糖尿病內環境促進了TxnIP與Trx的相互作用，抑制Trx的抗氧化應激功能，引起細胞內氧化應激水平的增加，提示TxnIP可能是糖尿病內環境下氧化應激保持高水平的機制。

3.4 Trx超表達抑制DN的進展 近年來研究證實凋亡可導致自身免疫性及藥物性糖尿病胰島β細胞的損害，ROS的細胞毒性可損害1型糖尿病患者的胰島β細胞。Hotta等〔14〕通過實驗證實Trx可保護胰島β細胞，減少凋亡與氧化應激對它的損害;Trx在胰腺細胞中的超表達可減少1型糖尿病的發生。

Hamada等〔15〕對8 w大的雄性Trx轉基因鼠(Trx-Tg)與野生型同窩鼠(WT)分別給予鏈脲佐菌素或檸檬酸鹽載體喂養。24 w后，通過對四組小鼠血液及尿液的生化分析及腎臟的組織學分析，來評估氧化應激與糖尿病腎病的腎臟損害程度。結果顯示:糖化血紅蛋白(HbA1c)水平在糖尿病Trx-Tg與糖尿病WT之間并無顯著差別;而糖尿病Trx-Tg中尿蛋白的排泄卻明顯低于糖尿病WT;與糖尿病WT相比，糖尿病Trx-Tg中TGF-β的表達顯著下降，腎小球系膜基質膨脹和腎小管損傷均被抑制;同時，糖尿病Trx-Tg尿中氧化應激標志物8-OHdG與acrolein adduct的排泄低于對照組，且它們在腎臟中的免疫染色強度也弱于糖尿病WT，通過Trx的超標達全身及腎臟的氧化應激減弱了。這個實驗提示氧化應激與DN進展的相關性以及Trx抑制DN進展的潛在可能性。

4 展望

作為內源性氧化應激抑制劑，Trx的超標可能對于DN的進展具有抑制作用。最新研究顯示，Trx可保護視網膜神經節細胞免受藥物誘導的氧化應激損害〔16〕，同時Trx的超標達可通過抑制應激誘導的凋亡，對糖尿病鼠的胚胎具有保護作用〔17〕。相反，TxnIP的過度表達介導了氧化應激，造成相應組織器官的損害。Trx、TxnIP、氧化應激與DN之間關系的研究為DN的發病機制及治療提供了一個新思路，沉默TxnIP基因、開發TxnIP抑制劑或Trx激動劑可能成為未來DN治療中新的切入點。

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