血腦屏障中P-糖蛋白的調節機制

王玉璘，王少峽，郭 虹，胡利民

(天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津市現代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193)

中樞神經系統疾病是危害人類身體健康疾病的主要類型之一。但臨床前大量候選藥物很難在臨床應用中顯示出其應有的療效，其中血腦屏障對藥物的屏蔽作用是主要原因之一。緊密連接和位于血腦屏障中的多種外排轉運蛋白對藥物從血液入腦起了重要限制作用。由于很多脂溶性藥物是P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的底物，因此P-gp的作用不容忽視。了解在生理病理狀態下P-gp的調節機制和特點對新藥研發以及提高臨床用藥安全性和有效性具有重要指導意義。本文對P-gp基本結構、分布、功能和在生理、病理及藥物干預下血腦屏障中P-gp調節機制的研究予以綜述。

1 P-gp的基本結構

P-gp屬ABC(ATP binding cassette)轉運蛋白超家族。人類P-gp的分子量為170 ku，由1 280個氨基酸組成。它有兩個串聯重復序列TMD1和TMD2，每個序列由610個氨基酸構成，他們的連接區是一條由60個氨基酸組成的多肽。在串聯重復序列中，他們各自都存在包含有6個跨膜α-螺旋序列的疏水區和1個在細胞胞質側的親水性核苷酸結合區。兩個重復序列各自的6個跨膜環與藥物結合和轉運相關，核苷酸結合區與ATP結合/水解相關。兩個ATP結合位點都能結合ATP，但不能同時參與ATP的水解［1-2］。

2 P-gp的組織分布

P-gp及其亞型存在于大量物種中。通過對人體組織冰凍切片免疫組化染色，可以確定P-gp在生理狀態下分布的情況。例如在下消化道黏膜表面、腎臟刷狀緣、肝臟膽小管表面、心臟、肺、胰腺、睪丸、胎盤、腎上腺皮質、部分免疫細胞、某些造血干細胞、血腦屏障內皮細胞、脈絡叢上皮細胞中均發現有P-gp的分布［2-3］。應注意在某些病理條件下，P-gp在星形膠質細胞中也存在表達［4］。P-gp廣泛存在于人體當中，因此當使用P-gp抑制劑時也可能抑制身體這些部位的P-gp以及與P-gp底物有重疊的轉運蛋白和酶，從而造成血藥濃度升高，膽汁清除率與腎臟清除率降低，增加全身毒性。因而P-gp抑制劑的開發必須在各試驗階段仔細評價全部藥物代謝動力學的結果。

3 P-gp的轉運功能

P-gp底物種類極多，分子量從210 u(茚地那韋)到約1 900 u(短桿菌肽D)［5］的脂溶性藥物、有機兩親性分子都是它的底物。在血腦屏障中，P-gp的底物大部分為藥物、毒素等異生物質，但P-gp也轉運一些內源性底物，比如β-淀粉樣蛋白、神經節苷脂GM1［6-7］等。P-gp在血腦屏障中的作用已被廣泛接受。Schinkel等通過基因敲除，有力地證明了P-gp在血腦屏障中的作用。他們通過對mdr1a(-/-)、mdr1b(-/-)和mdr1a/1b(-/-)基因敲除的小鼠進行的研究［8-9］和 Yousif等［10］的定量 RT-PCR 實驗結果表明在大鼠和小鼠中，mdr1a存在于腦微血管內皮細胞中并起主要的外排轉運作用，而沒有發現mdr1b存在。

盡管P-gp的基因、蛋白序列、分布、功能、底物特異性方面在不同種屬，甚至不同部位之間或多或少有所不同［11］，但其主要特性包括調節機制仍有很多相似之處，這也為研究血腦屏障提供了一定的參考。

4 誘導P-gp的表達和轉運功能的信號通路

4.1配體激活型核受體孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)是一種配體激活型核受體，它可被廣泛的內源性和外源性物質激活。PXR是一個在細胞核分子水平上調節異生物質轉運的“調節長官”，可以調節很多外排轉運蛋白［12］。PXR廣泛分布于肝臟、腎臟和腸的部分區域中，但由于腦微血管占腦體積分數不到1%，因此在早先的實驗中，PXR并沒有在大腦勻漿中被檢測到［12-13］。Bauer等首先檢測到PXR在腦中表達并通過核受體調節血腦屏障中外排轉運蛋白的表達，其中包括P-gp。他們在體內和體外實驗中發現給予大鼠PXR配體如地塞米松和pregnenolone-16α-carbonitrile(PCN)，或給予表達人類PXR(hPXR)的轉基因小鼠hPXR配體如利福平，都可以上調P-gp在腦內的表達，增強對熒光標記的環孢菌素A的轉運功能［14-15］。PXR的DNA結合域是一個高度保守的序列，但配體結合域反之，因此在不同種屬之間同一配體對其親和力有明顯差異，例如PCN是典型的嚙齒類動物PXR的配體，而不是人hPXR的;利福平是hPXR的高親和性配體，而不是嚙齒類動物PXR的。然而，Akanuma等［16］卻未能檢測出PXR在大鼠腦微血管的mRNA表達，推測可能是由于PXR在腦微血管內皮細胞表達的種屬差異造成的，或者是PXR在腦微血管內皮細胞表達與年齡有關。

此外，與PXR相似，雄甾烷受體(constitutive androstane receptor，CAR)、芳(香)烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)、糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor ，GR)［17-18］也很可能參與血腦屏障中P-gp的上調。但PXR、CAR在人腦微血管和皮層的表達和所起作用的程度還存在爭議，因為Dauchy等［19］在癲癇和神經膠質瘤成年患者的皮質樣本和微血管中沒有檢測到PXR，而CAR的含量也微乎其微。令人鼓舞的是AhR的含量在人腦微血管和皮質中較多，且在腦微血管的含量是皮質的2.7倍。當然也有可能是癲癇和神經膠質瘤影響了配體激活型受體的mRNA在人腦內的含量。

4.2炎癥與氧化應激NF-κB是參與基因轉錄的蛋白質分子，調控多種基因的表達，廣泛分布于人體各組織細胞中，參與調控機體多種生命活動如:多藥耐藥性、炎癥反應、免疫反應、細胞凋亡以及腫瘤發生與轉移等。它可被多種應激偶聯的信號所激活(如細胞因子、缺氧、活性氧、熱激、重金屬)，在細胞保護方面起到了重要作用，但同時又介導著細胞調節通路。對于血腦屏障，它可對抗由于缺血/再灌注損傷、中風及腦外傷造成的損害［20］。Pan 等［21］通過對 NF-κB 基因敲除的小鼠P-gp mRNA和蛋白表達水平的分析發現，NF-κB雖然不能改變自然狀態下小鼠腦微血管mdr1a的水平，但可介導LPS誘導的mdr1a mRNA的增加，參與維持P-gp的外排轉運的功能。Bauer等還發現給予內皮素-1(endothelin-1，ET-1)或腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的微血管段在2～3 h內時明顯抑制P-gp的表達和轉運功能，但隨時間推移P-gp的表達及其轉運功能迅速激活，到6 h時蛋白表達量和轉運功能是對照組的兩倍。研究發現，在ET-1或TNF-α長時間作用下，明顯誘導P-gp的表達。增強其轉運功能的機制可能是通過激活NF-κB，從而誘導P-gp表達。而2～3 h內的短時程刺激，雖然與長時程刺激中間信號轉導過程十分類似，但區別其一是長時程刺激不僅有ETB也有ETA受體參與，而短時程刺激并沒有發現ETA受體參與;其二是長時程刺激最終激活了NF-κB通路，而短時程并沒有體現出NF-κB的作用［20，22］。實驗表明對于腦微血管內皮細胞，通過NF-κB通路可以介導由氧化應激［14］、HIV-TAT蛋白［4］、炎癥［20］等引起的P-gp表達的上調。但是 Nwaozuzu等［23］發現在H2O2誘導的P-gp表達中NF-κB似乎起著消極作用，這可能由于H2O2直接抑制了的IκB上游激酶或者加強了另一個位點的磷酸化從而抑制絲氨酸磷酸化，既而抑制了NF-κB通路，并且有文獻報道隨著H2O2的濃度、作用時間、細胞種類、模型等的不同其對NF-κB的作用也不同［24］，同時可能通過其他機制如細胞外信號調節酶(ERK1/2)、應激激活蛋白激酶(SAPK)、轉錄因子如PXR、c-Jun或未經發現的某些機制誘導了P-gp的表達。

柴油機排氣微粒(diesel exhaust particles，DEPs)通過誘導氧化應激和促炎癥信號通路上調P-gp的表達和轉運功能。值得注意的是，該過程中細胞內TNF-α含量增加并激活了TNF-R1，但其下游并沒有通過PKC、NF-κB通路，而是激活的TNF-R1，通過激活JNK激酶、c-jun，進而影響AP-1，而使P-gp的表達增加。雖然DEPs激活了一氧化氮合酶，但并沒有發現NO在通路中起到作用［25］。

缺乏谷胱甘肽(GSH)可以使血腦屏障處于一個慢性氧化應激狀態，研究發現，缺乏GSH同樣可以誘導P-gp上調［26］。然而 Wartenberg 等［27］卻發現在腫瘤細胞中缺乏GSH可以下調P-gp的表達。這可能與GSH缺乏的程度，和不同細胞有關。

作者認為氧化應激是一個復雜的進程，不僅對P-gp的調控顯出復雜并有爭議的結果，在對NF-κB的作用上也存在相似的爭議性結果。氧化應激過程包括了活性氧、促炎細胞因子、炎癥趨化因子、激酶、轉錄因子等多種因素的參與，他們在不同細胞、不同模型、不同濃度、不同作用時間、不同發展進程等都會有不同的差異，因而在不同的氧化應激類實驗中出現了不同的結果，還有待將來實驗的進一步解釋完善。

4.3癲癇癲癇通過增加大腦胞外谷氨酸鹽含量，通過N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA receptor)和環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)而增加P-gp的表達和活性［28］。雖然很多抗癲癇藥可有效控制癲癇發作，但仍有一部分病人對抗癲癇藥不敏感。抗癲癇藥的作用機制不盡相同，但它們藥代動力學的機制卻有著共同之處。對于難治性癲癇，其機制之一與外排轉運蛋白有關，如P-gp在血腦屏障的過表達［29］。并且有研究發現癲癇可以誘導血腦屏障中P-gp的表達，通過給予P-gp抑制劑如:維拉帕米，減少了難治性癲癇的發作次數［30］。

4.4HIVHIV-1 tat蛋白體外可以誘導P-gp的表達，通過完整的脂筏和Rho信號通路上調P-gp基因水平的表達和轉運功能［4］。Langford等［31］卻發現HIV血清陽性合并腦炎的病人，其腦微血管上表達的P-gp低于HIV血清陽性無腦炎的病人，但在星形膠質細胞和小膠質細胞卻有明顯增加。

5 抑制P-gp的表達與轉運功能的信號通路

5.1炎癥與氧化應激前面已述及當 Bauer等［20］，Hartz等［32］用 ET-1、TNF-α、脂多糖(lipopolysacchride，LPS)進行短時程刺激后P-gp的表達以及轉運功能明顯下降，3種刺激因子最終共同作用于依次為ETB受體、NOS、PKC通路，抑制P-gp的功能和表達，此外LPS也可不通過ETB受體通路直接誘導NOS生成，且不受PKC抑制劑抑制，而使P-gp的功能和表達降低。最近研究表明PKC的β1亞基對LPS誘導的大鼠腦微血管P-gp功能和表達的降低具有重要作用，將來或許可以作為降低P-gp表達和功能的靶點［22］。

Goralski等［33］的在體實驗也得到了與 Bauer、Hartz等相似的結果。對于單純的炎癥因子刺激其對腦內P-gp的調節是先降低后升高的趨勢。雖然在他們實驗中，長時程P-gp表達相對對照組的增加量沒有統計學意義，但分析其圖表數據發現增加的趨勢一致。

而氧化應激(如中風)對P-gp調節作用的報道并不一致。因為其是一個復雜的過程，包括缺血/再灌注、炎癥、凋亡等進程。缺血/再灌注可簡單的理解為氧化應激，氧化應激的模型可以是過氧化氫刺激，缺氧/復養損傷等。模型的活性氧損傷強度又可以隨著過氧化氫濃度、缺氧/復氧的時間而改變，因此弄清氧化應激對P-gp的確切機制是一個十分復雜的實驗過程，我們必須弄清氧化應激相關實驗在不同實驗模型、強度、時程、發生部位的條件下對P-gp的不同影響。加之在中風后期還伴隨有炎癥、細胞凋亡等，使中風對P-gp的表達的調節作用更加復雜。

5.2血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)VEGF通過flk-1受體和Src激酶信號通路也可快速且可逆地抑制P-gp的表達和轉運功能。機制可能是與VEGF使P-gp從毛細血管腔面的細胞膜移除有關，而這可能是Src激酶對小窩蛋白-1磷酸化造成細胞內化或者使P-gp的構象發生變化所致，尚需今后實驗進一步探討。需要注意的是，PKC β1亞基途徑造成的P-gp表達和轉運功能降低的機制并不是通過P-gp從膜移除所致［34］。

5.3阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)AD是一種常見的以進行性認知障礙和記憶損害為主要臨床特征的神經退行性疾病，以過度磷酸化的tau蛋白造成的神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)、神經炎性斑塊(neuritic plaque，NP)、β 淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)沉積形成老年斑、神經元大量缺失為主要病理特征。近年研究發現，Aβ的分泌過程是產生AD的觸發因素，而tau蛋白是導致神經退行性病變的重要繼發因素。Kuhnke等［6］發現P-gp可以介導β淀粉樣肽的外流，并且研究發現在老齡人群中Aβ與 P-gp的含量成負相關［35］。但是 Yamada等［36］并沒有發現維拉帕米這一P-gp抑制劑在細胞對125I-Aβ(1-40)的攝取上有明顯作用［36］。推測這可能與各自所用細胞下P-gp的表達量不同有關。盡管P-gp對Aβ的作用的大小尚存在爭論，但P-gp確實對Aβ進入血腦屏障起著一定的作用，這也將是未來治療AD的一個潛在靶點。

5.4帕金森病臨床數據發現，血腦屏障中P-gp的功能在帕金森病早期時并沒有明顯下降，但在疾病進程后期發現其功能有明顯降低［37］。但是隨后大樣本量的PET研究并沒有重復出先前的結果，推測P-gp的損傷在帕金森病進程中可能并不起主要作用［38］。

6 P-gp抑制劑

P-gp抑制劑發展歷經了3代。應用P-gp抑制劑同樣可以抑制P-gp的轉運功能。目前通常抑制劑發揮作用的主要機制包括:抑制底物與P-gp結合位點結合，包括競爭性抑制和非競爭性抑制;抑制ATP水解;抑制P-gp的轉錄與翻譯過程;將P-gp從細胞膜中移除。需要說明的是，并不是所有抑制劑對ATP酶有抑制作用。因為與底物競爭位點的抑制劑，如維拉帕米是一種高效耗能的P-gp底物，它通過與底物競爭P-gp的結合位點來達到抑制P-gp轉運底物的作用，但并不干擾P-gp的催化循環，反而使ATP酶活性增加［2］。又如加蘭他敏在低濃度(＜1μmol·L-1)時ATP酶活性升高，而高濃度(＞5μmol·L-1)時 ATP酶活性降低［39］。同樣，P-gp抑制劑也并不都能抑制P-gp的轉錄和翻譯。如維拉帕米在高劑量(0.1 mol·L-1)時可以促進K562/ADR細胞P-gp的轉錄［40］。由于很多抑制劑是與底物競爭結合位點的，而P-gp分別與CYP3A多藥耐藥相關蛋白(multi-drug resistance-associated protein，MRP)有著底物的重疊，加之P-gp的誘導劑、底物很多也是核受體如PXR、CAR、AhR的配體，而這些配體同樣還控制著如 CYP3A4、MRP、BCRP［18］等代謝酶和轉運蛋白，所以在使用P-gp抑制劑進行治療時，一定要慎重考慮藥物間的相互作用。

7 總結

鑒于P-gp在生理和病理過程中發揮的重要作用，我們有必要弄清調節P-gp的信號通路。如今，對于血腦屏障中P-gp的研究日益增多，研究發現基因、疾病、異生物質、一些細胞信號分子以及藥物、飲食等都可以調節P-gp。但是對基于人血腦屏障的P-gp的研究還比較有限，由于物種差異性我們必須在基于對各種細胞系以及動物血腦屏障P-gp的研究基礎上，進一步開展對人血腦屏障的研究，趨利避害，從而更好地指導臨床用藥和新藥開發。

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