代謝組學及其在心血管疾病中的研究進展

石 潔,胡元會

1999年英國皇家理工大學Nicholson教授及其同事首次提出代謝組學的概念[1]。代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后,系統生物學的重要組成部分,是系統研究代謝產物的變化規律,解釋機體生命活動代謝本質的科學。它通過高通量、高靈敏度與高精確度的現代分析技術分析細胞、組織和體液中內源性代謝物整體組成,通過研究代謝物的動態變化來辨識和解析被研究對象的生理病理狀態。隨著代謝組學進一步的發展以及代謝多層次多方面的深入研究,代謝組學在心血管疾病中取得一些進展。本文就代謝組學及其在心血管疾病研究中的進展做一綜述。

1 代謝組學基本概況

代謝組學是一門在新陳代謝的動態過程中,系統研究代謝產物的變化規律,解釋機體生命活動代謝本質的科學。是一項動態的、多參數應答的新技術、新方法,反映的是基因、環境、致病因素、營養、藥物、時間等諸多因素綜合作用于機體后的總反映,是判定健康、疾病和治療效果合適的分子集合。簡而言之,基因組學和蛋白質組學告訴我們可能發生什么,而代謝組學則告訴我們已經發生了什么[2]。細胞內的生命活動離不開物質代謝,而基因、蛋白質的生命調控效應最終也需落實在代謝層面上,因此,代謝組學被認為是基因組學和蛋白質組學的延伸,是“組學”研究的最終方向,它跳過生命體內的復雜調控過程,通過對代謝物的分析給出最終的、整體的結果,這是其在健康評估、疾病診斷、療效評價等方面巨大應用前景的優勢所在[3,4]。隨著這些組學研究的深入,科學家們逐漸認識到:基因組的變化不一定能夠得到表達,從而并不對系統產生影響。某些蛋白的濃度會由于外部條件的變化而升高,但由于這個蛋白可能不具備活性,從而也不對系統產生影響。同時,由于基因或蛋白的功能補償作用,某個基因或蛋白的缺失會由于其他基因或蛋白的存在而得到補償,最后反應的凈結果為零。而小分子的產生和代謝才是這一系列事件的最終結果,它能夠更準確地反映生物體系的狀態[5]。

代謝組學關注的對象是分子量1 000以下的小分子化合物。根據研究的對象和目的不同,Oliver[6]將對生物體系的代謝產物分析分為4個層次:①代謝物靶標分析(Metabolite target analysis):某個或某幾個特定組分的分析;②代謝輪廓分析(Metabolic profiling):少數預設的一些代謝產物的定量分析。如某一類結構、性質相關的化合物(氨基酸、有機酸等)或某一代謝途徑的所有中間產物或多幾條代謝途徑的標志性組分;③代謝組學(Metabolomics):限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分的定性和定量;④代謝物指紋分析(Metabolic fingerprinting):不分離鑒定具體單一組分,而是對樣品進行快速分類(如表型的快速鑒定)。

完整的代謝組學流程包括樣品的采集、預處理、數據的采集和數據的分析及解釋。通過測定生物體液、細胞提取物、細胞培養液或組織中代謝物的變化,參照正常代謝信息,將所得的大量數據用生物信息學、化學信息學、統計學方法進行比較分析,發現其內在的聯系,為臨床提供客觀的信息。檢測樣本常用的是血漿、尿液、唾液。其研究平臺主要由分析技術平臺和數據分析平臺構成。代謝組學力求分析生物體系(如體液和細胞)中所有代謝產物,所以整個過程中都強調盡可能地保留和反映總的代謝產物的信息[7]。支撐起代謝組學的技術方法包括:一維核磁共振(1H NM R Spectroscopy,1H-NM R)、氣相層析質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相層析質譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、傅立葉層析質譜(Fourier T ransform mass spectrometry,FTMS)、高效液相質譜(high performance liquid chromatography,HPLC)、電化學陣列(electrochemical array,EC-array)。運用偏最小二乘法,判別分析法(PLS-DA)[8]或人工神經網絡[9]等方法建立數據模型,就可以對這些來自不同樣本的生物學信息進行預測分析。

2 代謝組學在心血管疾病中的研究進展

有研究應用1H-NMR技術以36例嚴重心血管疾病患者和30例心血管動脈硬化患者的血清和血漿為研究對象進行了代謝組學分析,結合主成分分析(Principal Components Analysis,PCA)、SIMCA(Soft Independent Modelling of Class Analogy)、偏最小乘方分析(PLS-Discriminant Analysis,PLS-DA)、OSCPLS等模式識別技術實現了對心血管疾病及其嚴重程度的判別,得到了＞90%的靈敏度及專一性。Brindle等[10]還運用NM R對不同血壓水平人群進行血清代謝組學檢測后發現,正常人同血壓偏高一級高血壓患者存在代謝組學差異,充分證實了高血壓的發生、發展有著其內在的代謝組學本質,代謝組學能夠即時、靈敏表征高血壓患者的整體功能狀態變化。

祖國醫學理論體系的基本特點是整體觀念和辨證論治。在整體觀念的指導下,中醫學認為人體是一個有機的整體,各個組織、器官、系統的功能是相互聯系、相互影響的。辨證論治是中醫的精髓,在這里的“證”即指證候,是一個綜合征,是個體對內外環境的整體性反應狀態,證候具有復雜性、模糊性、多樣性和變化性等特點。代謝組學采用的是“自上而下”式的研究方法,是對代謝的終端產物進行多元化綜合分析,從整體上展示生物體內在的變化狀態,避免了以往采用單一指標或少數幾個指標研究某種病理和生理變化[11],這與中醫學的整體觀念十分吻合,從而為中醫證候研究提供嶄新的技術平臺。代謝組學在心血管疾病證候標準化研究中已經取得了一些進展。

劉衛紅等[12]運用高脂飼料喂飼法復制大鼠高脂血癥模型,通過動態觀察高脂血癥、動脈粥樣硬化發病過程中的代謝產物,探討高脂血癥、動脈粥樣硬化痰證、瘀證演進過程中的生命標志物,解釋痰瘀證候的動態演變、時相特點和由痰致瘀的條件。從1H NMR圖譜及模式識別分析發現:①正常對照組與模型組之間存在代謝產物譜的證顯著差異,隨著造模時間延長,模型組不同時間點樣本之間能較好地分開,說明血漿代謝組學分析較好地反映疾病證候的動態演變;②在1H NMR圖譜中可以發現乳酸、乙酸、丙氨酸、葡萄糖、氧化三甲胺、O-乙酰糖蛋白、膽堿、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白(LDL/HDL)、不飽和脂肪酸等的譜峰強度改變較為明顯。乳酸是體內三羧酸循環的中間產物,其代謝異常是能量代謝紊亂的標志;丙氨酸的代謝異常與腎小球濾過和回收功能有關;乙酸代謝異常則是肝功能損傷的標志;膽堿是一種維生素類化合物,它對細胞膜完整性及脂類消化運輸發揮重要作用。說明高脂血癥大鼠體內不僅脂肪和能量代謝紊亂,并存在肝腎功能的損害。③隨著造模時間的延長,由2周的VLDL升高,經4周時各種脂肪酸和血糖升高,至8周時以 N-乙酰糖蛋白、酮體、肌酐以及乳酸升高為主。這些結果表明,高脂血癥前期以脂質代謝紊亂為特點,及高脂血癥痰濁的生化物質基礎,隨著病程進展,乙酰糖蛋白,尤其是O-乙酰糖蛋白的出現,說明凝血機制出現異常。因為參與血液凝固過程的纖維蛋白原、凝血酶原和集中凝血因子都是糖蛋白。因此,乙酰糖蛋白譜峰的改變可能是高脂血癥大鼠模型血瘀的早期生物標志物。

朱萱萱等[13]選取住院并經冠脈動脈造影確診為冠心病的患者90例,辨證為痰阻心脈、氣陰兩虛、氣虛血瘀及氣滯血瘀4型,采用基于氣相色譜/飛行時間質譜(GC/TOF-MS)的代謝組學技術分析冠心病不同證型間的血清代謝物變化規律。結果顯示,冠心病患者與健康人、冠心病患者之間在代謝組學方面存在差異。男性的score plot圖中,健康對照組、氣虛血瘀證和痰阻心脈證相應集中在3個不同區域,完全沒有重疊,區分度很高。女性的score plot圖中,健康對照組、氣虛血瘀證、痰阻心脈證和氣陰兩虛證相應集中在4個不同區域,基本沒有重疊,區分度也很高。提示代謝組學方法可能成為冠心病的病因病機以及中醫辨證分型的新研究手段。

簡維雄等[14]通過對心血瘀阻證大鼠血漿的代謝產物、血液流變學指標的變化,以及養心通脈方干預后指標改變的分析識別,探討大鼠心血瘀阻證血漿代謝產物的“組裝”規律。將 32只大鼠分為模型組、空白組、養心通脈方組、假手術組4組,運用GC-MS法進行血漿代謝組學研究,鑒定各組共有峰,通過對不同組之間代謝產物含量的變化進行PCA,同時檢測分析各組血液流變學指標。結果顯示,模型組全血黏度、血漿黏度指標高于其余3組;大鼠血漿樣品散點圖顯示模型組與空白組、養心通脈方組、假手術組完全分離。因子載荷圖表明乳酸、丙氨酸、纈氨酸、琥珀酸、蘋果酸、硬脂酸、花生四烯酸等代謝物質含量明顯增高,果糖含量明顯降低。養心通脈方干預后代謝物含量、血液流變學指標均不同程度的回調。因此可以認為,發生改變的乳酸、丙氨酸、纈氨酸、琥珀酸、蘋果酸、硬脂酸、花生四烯酸、果糖等8種代謝物與反映“血瘀”病理的血液流變學指標的改變具有一致性,有可能作為心血瘀阻證代謝性生物標志物。

嚴蓓等[15]建立了心血瘀阻和氣陰兩虛證心肌缺血大鼠模型,基于GC/TOF-MS檢測技術的代謝組學方法,分析血漿中的內源性小分子代謝物,發現兩種中醫證型和正常大鼠之間代謝圖譜存在明顯差異,數據處理和模式識別后各組可被清晰地區分,與正常大鼠相比,模型大鼠血漿中羥脯氨酸、蘇糖酸、谷氨酰胺、檸檬酸等化合物的相對含量發生了顯著變化。兩種證型大鼠間血漿中纈氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸、羥脯氨酸、賴氨酸、2-羥基丁酸、3-羥基丁酸、呋喃半乳糖、肌醇等化合物的相對含量存在統計學意義,這些化合物是區分這兩種中醫證型的潛在生物標志物。研究結果提示,這兩種證型與能量代謝異常、氧化應激反應、氨基酸代謝異常等體內變化密切相關,此法為探索這兩種基于心肌缺血的中醫證的科學內涵、病理機制及科學“辨證”提供了研究基礎。

3 結 論

代謝組學具有巨大的應用潛力和科學價值,但目前也存在著明顯的不足。對某一物種、某個組織或其細胞中所有代謝途徑中的所有代謝產物同時進行全面高通量的定性和定量分析,在理論上行得通。但目前,沒有任何一個分析技術能夠同時對代謝組中的所有化合物進行分析,只能通過選擇性地提取結合各種分析技術的并行分析來解決這個問題。代謝組學分析產生出海量的數據,但目前尚無有效數據分析手段能夠將得到的全部信息進行分析和解釋。為了解決這些問題,需要從以下幾個方面進行努力:建立更加快速和有效地代謝產物濃度分析方法;建立色譜、電泳和質譜原始數據處理的方法;建立代謝組學數據的數據庫;建立代謝產物數據的標準。如何把代謝組學數據與轉錄組學、蛋白質組學、遺傳學、酶學、代謝途徑和表現型分析的數據整合在一起,并給出生物學功能的解釋將是最大的挑戰。因此,有必要對研究對象從各個技術平臺平行研究,并進行整合,從而對疾病獲得全面的了解。隨著代謝組學技術的不斷進步,其在心血管疾病領域的應用必將更加廣泛,進一步提高心血管疾病的診治水平,提高人們的生活質量,延長壽命,減少社會醫療資源的大量浪費,促進社會經濟和諧發展。

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