臍血間充質干細胞治療帕金森病的研究進展

武曉華,陳乃耀

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見的神經系統變性疾病,該病主要病理特點為中腦黑質多巴胺能神經元(dopaminergic neuron,DN)嚴重缺失和紋狀體多巴胺神經遞質減少。目前臨床以藥物治療和手術治療為主[1]。不論是遞質替代還是外科手術均不能逆轉神經變性,不能重新增加多巴胺能神經細胞的數目。相反,由于左旋多巴的神經毒性、電極的刺激還會使神經細胞的數目進一步減少。因此,尋求一種從病理基礎上提高神經系統細胞數目的治療具有重要意義[2]。成體干細胞橫向分化的多潛能性為 PD的治療提供了新的思路和方法[3]。臍血間充質干細胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)是從臍帶血中分離和培養的一種多潛能成體干細胞,具有自我更新和多向分化潛能,在一定條件下可以分化成為神經元細胞。目前,根據UCB-MSCs的這些特性,應用UCB-MSCs治療神經系統疾病如神經退行性疾病,神經損傷和中風等的基礎和臨床研究已成為熱點,并取得了一定進展。

1 UCB-MSCs的生物學特性

人臍血是指臍帶內及胎盤近胎兒一側血管內的血液,含有豐富的干細胞和前體細胞,其主要包含造血干細胞和MSCs。經研究發現臍血中含有豐富的MSCs,其特性主要有:①細胞形態呈均一的長梭形,核漿比例大,細胞內含有豐富的細胞器,端粒酶活性高,增殖能力強,具有貼壁生長的特點;②適當誘導培養條件下,具有譜系內多向分化的特點和跨系分化的潛能;③表達 CD13、CD29、D44、CD54、CD58、CD90、CD95、CD105、CD166等免疫表型,不表達 CD14、CD34、CD40、CD45、CD50、CD68、CD80、CD86、CD117和 CD152等免疫表型;④強陽性表達抗原標記SH-2、SH-3、SH-4(人間充質干細胞特異性抗體),同時表達HLA-ABC等抗原和膠原Ⅰ,不表達HLA-DR抗原、共刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40/CD40L以及膠原Ⅱ、Ⅲ;⑤細胞多處于G0/G1期,具有良好的增殖分化能力,簡便易行的分離、純化程序,而且能分泌一些造血細胞因子,具有促進造血的作用;⑥是一種原始的免疫缺陷細胞,具有良好的免疫耐受性,同時有一定的免疫調節作用,能夠抑制T細胞活性。

2 UCB-MSCs應用于細胞移植所具備的條件

UCB-MSCs可應用于細胞移植,因其具備以下優點:①來源廣泛,采集方便,不會對供者造成任何傷害。②其中的干/祖細胞較骨髓中的干/祖細胞更原始,增殖分化能力更強。③淋巴細胞的免疫功能不夠成熟,移植物抗宿主病發生率較低。④微生物和腫瘤細胞污染的可能性小。⑤無社會、倫理及法律等方面的諸多爭議。⑥易于保存和運輸。⑦收集的臍血不僅可做異基因移植的供體,而且還可將之低溫保存數十年,用于自體移植治療相關疾病。這些優點使UCB-MSCs成為細胞移植理想的種子細胞,有著廣泛的臨床應用前景。

3 UCB-MSCs向DN分化的研究

研究表明,在特定的條件下,UCB-MSCs經過誘導在體內和體外均可分化為神經元樣細胞,并表達一些神經標志性蛋白。UCB-MSCs的分化機制還不完全清楚,UCB-MSCs在其細胞的基因組內有幾套“程序”,在不同的外界環境下,會有相應的一套基因開啟,從而分化成某種終末細胞;還有人認為 UCB-MSCs是通過與不同組織的細胞發生融合而實現向該組織分化的,UCB-MSCs跨胚層分化時需要通過細胞融合這一過程來最終分化成這些組織的特定細胞。

3.1 UCB-MSCs體外誘導分化為神經細胞 近年來,國內外學者對UCB-MSCs誘導分化為神經細胞的方法進行了大量研究,目前UCB-MSCs體外誘導分化為神經細胞的方法主要有:①細胞生長因子法,神經生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等;②化學誘導劑法,B-巰基乙醇(B-ME)、二甲基亞砜(DM SO)、丁羥基苯甲醚(BHA)等;③生長因子與化學誘導劑聯合;④其他,共培養或用接近生理狀態的條件培養液、基因轉染[4]、傳統中藥黃芩苷[5]等。Goodwin等[6]將第4代的UCB-MSCs以完全培養基加20 ng/mL bFGF,20 ng/mL EGF誘導7 d細胞形態發生明顯變化,細胞免疫化學及Westen blot均證實有細胞骨架蛋白B-tubulinⅢ,星形細胞膠質纖維酸性蛋白的表達。侯玲玲等[7]以DM EM/20%胎牛血清/和B-巰基乙醇(B-M E)預誘導 24 h,而后換二甲基亞砜(DMS0)和丁羥基苯甲醚(BHA)進行誘導UCB-MSCs 5 h后70%細胞呈現典型的神經元樣表型,免疫組化法檢測發現不同代數的MSCs均為神經元特異性烯醇化酶(NSE)和神經微絲蛋白M(NF-M)陽性,誘導6 h～8 h后組織化學檢測可見神經元特有結構尼氏體。Sanchez等[8]在N5神經生長培養基中,采用維甲酸(RA)和 NGF誘導 UCB-MSCs后,新生細胞在形態上接近神經細胞,并表達神經巢蛋白(nestin)、GFAP、NSE等神經細胞標志物。Jeong等[9]用 bFGF預誘導后,再用 DMSO、BHA聯合誘導 UCB-MSCs,細胞迅速向神經細胞快速分化,誘導后細胞呈現神經元樣形狀,免疫熒光檢測顯示,神經前體細胞標志巢蛋白呈陽性,成熟神經細胞標志物神經膠質細胞標志物。

以上研究證明,UCB-MSCs在不同培養條件或不同的因子作用下,可分化為具有神經元形態并表達神經元標記物的細胞,體外誘導UCB-MSCs的技術正趨于完善。

3.2 UCB-MSCs在體內向神經細胞分化 Dunyue等[10]在HUCB對腦外傷鼠模型的靜脈治療中取得成功,并在腦實質中檢測到被標記的神經元和星型膠質細胞。Ha等[11]和Chen等[12]將HUCB-MSCs靜脈輸注到大腦中動脈梗死(MCAO)大鼠體內,發現移植的M SCs存活,部分表達神經細胞特異性標志物GFAP、NeuN、MAP-2,接受移植的動物運動功能和NSS均有顯著改善。Willing等[13]將UCB-MSCs移植入局灶性腦缺血成年大鼠24 h后觀察到,成年大鼠記憶功能改善。吳芳等[14]對小兒腦癱患者應用 UCB-MSCs鞘內注入的治療方法,1次/周,治療4周后患兒的粗大運動功能中臥位與翻身、坐位、行走與跑跳功能及小腿三頭肌肌張力均得到明顯改善。

UCB-MSCs通過不同方式移植到動物模型體內,可在體內微環境中分化為神經細胞或星形膠質細胞,并使運動功能明顯改善。UCB-MSCs經體外誘導分化形成的神經元樣細胞在移植后仍可存活、增殖并遷移。

4 UCB-MSCs移植治療PD的研究現狀

4.1 UCB-MSCs移植治療PD的研究 細胞移植治療PD的目的是修復黑質神經元變性引起的紋狀體多巴胺能通路損傷。移植DN替代已經變性的神經元,恢復黑質紋狀體多巴系統的完整性并改善其功能,很可能是一項非常有前途的治療措施[15]。吳立克等[16]給患者應用 UCB-MSCs進行鞘內注射移植治療,以第3,4腰椎間隙為穿刺點,緩慢注入地塞米松2 mg,取UCB-MSCs注射液5 mL(干細胞數 500萬),在10 min內緩慢注入蛛網膜下腔,1次/周,4次為1個療程,共治療1個療程。可以一定程度地改善PD患者的臨床癥狀,提高患者生活質量。黃仕雄等[17]利用 Nurrl基因修飾HUCB-MSC來源的DN,移植入PD模型鼠紋狀體內,能有效地改善PD模型鼠的癥狀,提高移植后DN的整合及存活能力,保護了毀損紋狀體內殘存的DN。Fu等[18]研究報道,將源于人臍血的 MSCs在體外誘導分化成為DN,把轉化來的細胞移植到大鼠體內(這種大鼠是通過施加6-OH多巴胺神經毒素而人造的單側紋狀體損害的PD模型),在移植后的4個月,酪氨酸羥化酶染色在大鼠的新紋狀體內檢測到了移植的細胞,結果顯示,UCB-MSCs有可能用于治療PD。樊志剛等[19]將第三代 UCB-MSCs用Hoechst33258標記后植入大鼠紋狀體內,結果發現移植組較對照組阿撲嗎啡誘發的旋轉行為顯著改善,認為UCB-MSCs腦內移植能改善帕金森大鼠的行為缺陷,可作為治療神經變性性疾病的一種潛在的細胞資源。

4.2 UCB-MSCs治療PD的可能機制 盡管UCB-MSCs在神經系統的許多疾病如:腦梗死、腦損傷、脊髓損傷、神經系統變性疾病的細胞移植治療方面取得了很大的進展,但其在促進神經功能恢復方面的作用機制尚不完全清楚。目前認為UCBMSCs治療 PD的機制可能有:①UCB-MSCs移植入腦后,能形成表達神經標志性蛋白的神經元樣細胞或星形膠質細胞,產生的細胞可在受損部位周圍存活,甚至移行至全腦[20]。②UCBMSCs在中樞神經系統微環境下能分泌腦源性神經營養因子(BDNF)、bFGF等營養因子,或者刺激損傷部位產生內源性因子,促進損傷組織的修復并減少細胞凋亡。③UCB-M SCs是受損部位新生血管的主要組成細胞,可分化成血管內皮細胞和細胞外基質,幫助神經保護、促進血管發生[21]。④在腦內創造適宜的局部微環境,通過體外擴增或不同因子誘導分化的方法使UCB-MSCs分化為神經細胞后進行移植,替代受損細胞重建神經功能區和傳導通路[22]。

4.3 UCB-MSCs移植的方法及影響因素

4.3.1 移植途徑和方法 UCB-MSCs移植的途徑有:通過腦立體定位儀將 UCB-MSCs注入側腦室、紋狀體、海馬等;直接注射入腦室或蛛網膜下腔,通過腦脊液的流動將細胞帶到病變部位;注射入靜脈或動脈,使其通過血腦屏障到達病變部位,主要應用于鼠尾靜脈注射。

UCB-MSCs移植治療PD的方法主要有:一是將未誘導或修飾過的UCB-MSCs直接移植入體內,利用體內環境的信號誘導分化為合適的細胞[16]。另外一種方法是移植經過誘導或基因修飾過的UCB-MSCs,使其分化為所需要的神經細胞后再移植入體內[17]。

4.3.2 影響因素 UCB-MSCs的選取、分離培養方法,分化為神經細胞的效率,移植細胞的類型、數量、合適的比例、合適的移植位點,UCB-MSCs對細胞外環境的影響以及細胞外環境對UCB-MSCs的影響,腦中內源性因子的作用以及UCB-MSCs在腦內存活時間對移植療效均有一定的影響。Karen等[23]發現,UCB-MSCs分離較為合適條件是,樣本保存時間不超過15 h,樣本中血液體積要超過33 mL,并且血液中沒有血凝塊合胰酶,單份血液中的 MSC要超過108。Buzanska等[24]將貼壁后的UCB-MSCs在含EGF培養基中培養6周,獲得nestin陽性的細胞集落,隨后將這種細胞分別用多聚左旋賴氨酸、視黃酸和BDNF誘導,可分化為神經元、神經膠質細胞和少突膠質細胞;若與大鼠腦原代培養單層細胞共培養,也可獲得神經元和神經膠質細胞。Fu等[18]通過實驗發現,源于人臍血的MSCs在神經培養基(NCM)、SHH、FGF8中通過分步培養,可以誘導分化成為12.7%的DN,移植至PD模型鼠紋狀體后,旋轉數顯著減少至對照組的水平,但不能恢復到正常水平,移植的多巴胺能神經元的數量不足是其主要原因,熒光顯示跟蹤發現標記的細胞大多定位于前囟點前2.0到后0.6,從移植位置開始遷移了大約1.4 mm,幾乎貫穿了整個紋狀體。Sawamoto等[25]研究發現人臍血來源MSCs能夠在實驗組大鼠腦內長期存活(至少8周以上),且發生遷移,同時表達神經細胞抗原 NSE,GFAP,T H,并且實驗組多巴胺含量明顯增加,這表明MSCs在大鼠腦內微環境的作用下可模仿神經干/祖細胞的行為。因此在臨床應用研究中除了用UCB-MSCs誘導分化而來的細胞替代缺乏或喪失功能的細胞外,也應該考慮聯合培養多種細胞來重塑細胞外環境,從而提高移植細胞的存活和增殖分化的能力。

5 展 望

目前雖然對UCB-MSCs的研究已取得了較大進展,其在人類醫學上的應用價值也已逐漸得到了肯定,但UCB-MSCs的研究尚處于起步階段,仍存在許多尚待解決:尚未尋找到完善的分離、培養和擴增UCB-MSCs的方案。至今尚未篩選到其特異性的標記分子,仍未能建立鑒定 UCB-MSCs的統一標準。誘導UCB-MSCs向多系分化的分子機制有待進一步研究。在UCBMSCs的臨床應用中,哪一分化階段的細胞最適于移植?采用何種途徑進行移植最佳?有待于進一步的探討。在移植應用過程中,植入的UCB-MSCs分化生成的細胞是否能夠融入相應的組織器官并發揮特定功能,具體作用機制如何?UCB-MSCs移植的近遠期安全性問題,有無致瘤性等也亟待更完善的解決方案。UCB-MSCs治療PD能否保持長期療效,且與目前存在的其他治療方法相比是否具有優越性?還有待進一步分析。盡管目前UCB-MSCs作為一種真正意義上的種子細胞還存在許多研究空白,但UCB的優勢是其他取材來源所無法比擬的。相信隨著UCB-MSCs研究的深入,其生物學特性會越來越明晰,在細胞治療、基因治療、組織工程及器官移植方面都會產生不可替代的作用。

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