川芎嗪、順鉑對人小細胞肺癌NCI-H446細胞凋亡的影響及機制探討

黃 波,郎賢平,王曉東

(遼寧醫學院附屬第一醫院,遼寧錦州 121000)

小細胞肺癌手術治療效果差,雖然對化療藥物敏感,但很快會產生耐藥。川芎嗪是川芎的有效成分之一。順鉑是常用化療藥物,對小細胞肺癌有一定療效,但后期易出現耐藥。有研究表明,化療藥物與川芎嗪聯合應用,可提高某些惡性腫瘤的治療效果[1]。我們的前期研究證實,川芎嗪聯合順鉑可抑制小細胞肺癌細胞株增殖[2]。為進一步研究其機制,2009年 6月 ～2010年 9月,我們觀察了川芎嗪、順鉑聯合應用對人小細胞肺癌NCI-H446細胞凋亡的影響,并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 人小細胞肺癌細胞株NCI-H446。鹽酸川芎嗪注射液,順鉑注射液。小牛血清和RPMI1640培養基,p53和Bcl-2一抗。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與培養 NCI-H446細胞株在含10%小牛血清的RPMI1640培養液中培養。將細胞用胰酶消化,制成單細胞懸液(1×105/m l),然后分為A、B、C、D組,分別接種于6孔板,每組3個平行孔,每孔接種細胞懸液2 ml。A組常規培養,B組加入川芎嗪培養液100μg/ml,C組加入順鉑培養液2 μg/ml,D組加入上述濃度的川芎嗪及順鉑培養液,均繼續培養72 h。

1.2.2 凋亡細胞檢測 吸去各組上清液,常規消化細胞;1 500 r/min離心5min,棄上清;PBS重懸細胞后,移至EP管中,1 500 r/min離心5 min。加5 μl的AnnexinⅤ-FITC溶液和2.5μl的PI至100μl細胞混懸液中,混合后室溫避光反應30 min,加入反應緩沖液 400μl,上流式細胞儀檢測。

1.2.3 各組細胞p53、Bcl-2蛋白檢測 采用Western blot法,按試劑盒說明書操作。以NC膜上出現清晰的棕褐色條帶為陽性,用凝膠成像系統對顯色條帶掃描的灰度值與 β-actin灰度值的比值表示p53、Bcl-2蛋白表達量。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。組間比較用 χ2檢驗及方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率比較 A組NCI-H446細胞凋亡率為5.23%±1.01%,B組為16.37%±1.23%, C為19.2%±1.51%,D組為21.2%±1.79%。B、C、D組與A組相比,P均＜0.01;D組與B、C組相比,P均＜0.05。

2.2 各組細胞Bcl-2、p53蛋白表達比較 見表1。

表1 各組細胞Bcl-2、p 53蛋白表達比較(±s)

表1 各組細胞Bcl-2、p 53蛋白表達比較(±s)

注：與A組相比,＊P＜0.05;與B、C組相比,△P＜0.05

組別 Bcl-2 p53 A組 0.87±0.003 5 0.19±0.002 3 B組 0.58±0.004 8＊ 0.31±0.001 4＊C組 0.32±0.003 9＊ 0.46±0.002 5＊D組 0.23±0.001 9＊△ 0.62±0.002 7＊△

3 討論

腫瘤不僅是細胞增殖和分化異常的疾病,也是細胞凋亡異常的疾病。細胞凋亡狀態及其調控基因的異常,可導致細胞生態平衡紊亂,參與腫瘤的發生發展。細胞凋亡的抑制是腫瘤發生的原因之一[3]。

川芎嗪具有抑制腫瘤新生血管形成的作用[4],其機制與促進免疫功能及抑制誘導細胞凋亡有關。有研究[5]觀察到川芎嗪有抑制肺腺癌 A549細胞增殖的作用,其抑制 A549細胞增殖的機制與其誘導細胞凋亡有關,并與化療藥物有協同作用。順鉑主要作用于DNA鏈間及鏈內交鏈,形成順鉑-DNA復合物,干擾DNA復制,或與核蛋白及胞質蛋白結合。本研究結果顯示,B、C、D組與A組相比,細胞凋亡率明顯上升,D組較B、C組上升。即川芎嗪、順鉑聯合應用,細胞凋亡率明顯高于單獨用藥。

Bcl-2是特異性抑制細胞凋亡的基因[5]。Bcl-2過表達可使細胞凋亡受抑制,細胞存活期延長并擴增,這是腫瘤發生的重要機制之一[6]。本研究結果顯示,B、C、D組與A組相比,NCI-H446細胞Bcl-2蛋白表達明顯降低,且D組低于B、C組。說明川芎嗪、順鉑均可降低小細胞肺癌細胞Bcl-2蛋白表達,兩者聯合應用抑制Bcl-2蛋白表達的能力進一步增強。抑癌基因 p53突變是人類癌癥中最頻發的基因事件之一[7],且與癌癥的演變過程密切相關。在肺癌中p53突變率為 60%～70%,對肺癌的早期診斷、預后判斷和療效觀察均有重要意義[8]。本研究結果顯示,B、C、D組與A組相比,NCI-H446細胞p53蛋白表達明顯增高,D組高于B、C組。說明川芎嗪、順鉑均可增強小細胞肺癌細胞的 p53蛋白表達,兩者聯合應用可使 p53蛋白表達進一步加強。

綜上所述,川芎嗪、順鉑聯合應用,小細胞肺癌NCI-H446細胞凋亡明顯增加,可能與其降低小細胞肺癌細胞中Bcl-2蛋白表達、增強p53蛋白表達有關。

[1]張會軍,閻蘊力,陰梅云.川芎嗪對依托泊苷誘導小細胞肺癌細胞凋亡的增敏作用[J].實用腫瘤雜志,2004,19(3)：229-232.

[2]黃波,劉志良,王曉東.川芎嗪、順鉑對小細胞肺癌 NCI-H446細胞株體外增殖的影響[J].山東醫藥,2010,50(42)：72-73.

[3]張曉暉,姚天明,黃高昇.細胞凋亡的最新研究進展[J].第四軍醫大學學報,2002,23(Suppl 1)：42-44

[4]徐曉玉,嚴鵬科,陳剛,等.川芎嗪對小鼠肺癌血管生長和VEGF表達的抑制[J].中國藥理學通報,2004,20(2)：151-154.

[5]Cory S,Huang DC,Adam JM.The Bcl-2 family：roles in cell survival and oncogenesis[J].Oncogene,2003,22(53)：8590-8607.

[6]馬紅,馬曉春.p53、Bcl-2蛋白在人類肺癌組織中表達的研究[J].中國冶金工業醫學雜志,2003,20(5)：333-335.

[7]Gemba K,Ueoka H,Kiura K,et al.Immunohistochemical detection ofmutant p53 protein in small-cell lung cancer：relationship to treatment outcome[J].Lung Cancer,2000,29(1)：23-31.

[8]Ebina M,Martinez A,Birrer MJ,et al.In situ detection of unexpected patterns ofmutant p53 gene expression in non-smallcell lung cancers[J].Oncogene,2001,20(20)：2579-2586.