p38MAPK抑制劑CBS3830對糖尿病大鼠自體靜脈移植內(nèi)膜增生的影響及機(jī)制探討

鄔 松,葛建軍,趙智偉,劉永志,周經(jīng)月

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,合肥 230022)

糖尿病(DM)患者70%～80%死于心血管系統(tǒng)并發(fā)癥[1],其中 3/4死于冠狀動(dòng)脈疾病[2],且大多為 2～3支冠脈受累。利用自體靜脈行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)是治療冠狀動(dòng)脈多支病變的常用方法,但術(shù)后靜脈橋狹窄率較高。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的新成員,參與多種細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳遞。研究發(fā)現(xiàn),p38MAPK信號傳導(dǎo)通路與靜脈橋狹窄的發(fā)生密切相關(guān)。2009年11月 ～2010年 6月,我們建立糖尿病大鼠自體靜脈移植模型,觀察p38MAPK抑制劑CBS3830對大鼠自體移植靜脈內(nèi)膜增生的影響,并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠30只,均為雄性,體質(zhì)量200～250 g,6～8周齡。CBS3830及其溶媒1%甲基纖維素,鏈脲佐菌素(STZ)。大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒,HE染色試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 大鼠糖尿病模型的建立 30只大鼠禁食(不禁水)18 h,將STZ溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH 4.4),行腹腔注射60 mg/kg;72 h后尾靜脈采血,用血糖儀測定血糖,血糖＞16.7 mmol/L為造模成功。26只大鼠成模,其余大鼠剔除。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 糖尿病大鼠隨機(jī)分為對照組及藥物組,各13只,采用改良cuff法將右頸外靜脈連接于同側(cè)頸總動(dòng)脈之間,建立自體靜脈移植模型[3]。造模前1 h藥物組經(jīng)胃管灌入0.3 mg/m l的CBS3830 1m l/100 g,對照組同法給予等體積的CBS3830溶媒1%甲基纖維素。術(shù)后分籠飼養(yǎng),喂標(biāo)準(zhǔn)食物,自由飲水,不用胰島素。

1.2.3 血清TNF-α檢測方法 分別于術(shù)前及術(shù)后1、3、7 d從大鼠眼球后靜脈采血,離心后取血清備用。采用ELSIA法測定血清TNF-α,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 大鼠移植靜脈內(nèi)膜增生情況觀察 術(shù)后 1周處死動(dòng)物,用4%中性甲醛在體固定移植靜脈;取出移植靜脈繼續(xù)用甲醛固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,切片厚約 5μm,按參考文獻(xiàn)[4]的方法行 HE染色,采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)采集圖像。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5處不連續(xù)的位置,測量內(nèi)膜及中膜厚度,計(jì)算內(nèi)膜厚度/中膜厚度,取均值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清TNF-α水平比較 見表1。

表1 兩組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清TNF-α水平比較(ng/L,±s)

表1 兩組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清TNF-α水平比較(ng/L,±s)

注：與對照組相比,＊P＜0.05

TNF-α組別 術(shù)前 術(shù)后1 d 3 d 7 d對照組 214.84±12.90 202.45±20.59 233.07±20.28 240.70±42.68藥物組 204.35±19.87 208.57±20.09 227.36±29.46 176.18±19.68＊

2.2 兩組大鼠移植靜脈內(nèi)膜及中膜厚度、內(nèi)膜厚度/中膜厚度比較 見表2。

3 討論

p38MAPK是MAPK家族成員之一,紫外線、熱休克、滲透壓、牽張、剪切力、缺血再灌注、氧化應(yīng)激以及IL-1、TNF-α等炎癥因子均可激活細(xì)胞的p38MAPK。p38MAPK被磷酸化激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)或轉(zhuǎn)移到其他部位,發(fā)揮對應(yīng)激條件下的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及對細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡過程的調(diào)控。因此,p38MAPK被認(rèn)為是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)或共同通路。

表2 兩組大鼠移植靜脈內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜厚度/中膜厚度比較(±s)

表2 兩組大鼠移植靜脈內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜厚度/中膜厚度比較(±s)

注：與對照組相比,＊P＜0.05

組別 n 內(nèi)膜厚度(μm) 內(nèi)膜厚度/中膜厚度對照組 13 38.5±1.50 1.70±0.12藥物組 13 33.6±1.34＊ 1.23±0.08＊

冠心病是糖尿病的血管并發(fā)癥之一,CABG是其主要的治療方法,大隱靜脈是使用最多的移植血管,但術(shù)后第1年即有12%～20%的移植血管發(fā)生阻塞,此后每年再有 4%的血管出現(xiàn)阻塞。移植血管發(fā)生阻塞的機(jī)制可能有以下幾方面：①手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷,使血管內(nèi)膠原纖維暴露而激活p38MAPK;p38MAPK激活后能產(chǎn)生血栓素,引發(fā)血小板聚集,從而導(dǎo)致移植血管閉塞。同時(shí),手術(shù)創(chuàng)傷亦可引起炎性細(xì)胞因子TNF-α等釋放,也可活化p38MAPK,而活化的p38MAPK又可通過正反饋機(jī)制加強(qiáng)TNF-α的表達(dá),從而導(dǎo)致血管內(nèi)膜的增厚。②糖尿病患者持續(xù)的高血糖可直接損壞血管內(nèi)皮,且血脂異常及游離脂肪酸增加均可導(dǎo)致氧自由基增多,從而激活p38MAPK,促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子(如TNF-α),參與移植血管內(nèi)膜的增生;陳惠玲等[5]研究發(fā)現(xiàn),平滑肌細(xì)胞接受不同濃度的H2O2刺激可激活p38 MAPK,從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生。③糖基化終產(chǎn)物 AGE與細(xì)胞表面特異性受體相互作用,是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的重要原因[6]。RAGE是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞膜受體,主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面。RAGE與其AGE結(jié)合可引起血管內(nèi)皮損傷、細(xì)胞基質(zhì)異常增生及血流動(dòng)力學(xué)、血液流變學(xué)異常等改變[7～9],其信號傳導(dǎo)是通過 AGE+RAGE→p38MAPK→NF-κB→細(xì)胞因子(如TNF-α)通路來實(shí)現(xiàn)的[10],進(jìn)而參與移植血管內(nèi)膜的增生。王欣等[11]研究發(fā)現(xiàn),自體靜脈移植的糖尿病大鼠血清中的AGE水平與移植血管內(nèi)膜的增生呈正相關(guān)。④糖尿病患者體內(nèi)的高滲透壓同樣可以激活p38MAPK,從而參與血管內(nèi)膜的增生、生長及平滑肌細(xì)胞的增殖。

本研究顯示,藥物組血管內(nèi)膜增生較對照組有明顯減輕,TNF-α表達(dá)明顯低于對照組。這提示p38MAPK抑制劑CBS3830對移植血管的內(nèi)膜增生有抑制作用,與其降低 TNF-α表達(dá)有關(guān)。因此,阻斷或調(diào)控MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性,有可能成為防治糖尿病患者CABG后移植血管內(nèi)膜增生的有效靶點(diǎn)。但糖尿病患者CABG后移植血管的內(nèi)膜增生是多因素作用的結(jié)果,具體機(jī)制復(fù)雜,有待進(jìn)一步研究。

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