介導EGFR siRNA轉染肝癌HepG2細胞的試劑篩選及條件優化

陳 罡,黨裔武,羅殿中

(廣西醫科大學第一附屬醫院,廣西南寧 530021)

RNA干擾(RNAi)已廣泛用于沉默或降低靶基因及靶蛋白的表達。小干擾RNA(siRNA)必須進入細胞內才能發揮對基因的沉默作用 ,將外源性siRNA高效地轉入靶細胞是基因抑制成功與否的關鍵。基因siRNA轉染方法眾多,如磷酸鈣沉淀法、電穿孔、脂質體法、顯微注射法、逆轉錄病毒法、Magnetofection法等[1]。Magnetofection法是采用磁性納米微粒(Nanoparticles)與siRNA結合成磁性復合體,在磁力的作用下進行細胞轉染,該方法還可與其他轉染方法如脂質體法結合使用,提高siRNA轉染效率[2]。2010年 7月,我們比較了 7種轉染試劑介導表皮生長因子受體(EGFR)siRNA轉染肝癌HepG2細胞后的基因敲除率,并對轉染條件進行了優化。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細胞、FBS、DMEM培養基。靶向EGFR及GAPDH特異性siRNA、EGFR scrambled siRNA、Opti-Mem、Lipofectamine 2000、siPORT Amine、ICAFectin 442、N-TER nanoparticle、X-tremeGENE、polyMagnetofection、combiMAGnetofection轉染試劑,cDNA第 1鏈合成逆轉錄試劑盒, CellTiter96 AQueous One Solution試劑盒,siGLO和TOX陽性轉染試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 EGFR siRNA的合成 EGFR siRNA由Invitrogen設計并合成,序列為3′-GCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTAT-5′。陽性GAPDH siRNA購自Invitrogen。Scrambled siRNA通過www.sirnawizard. com/scrambled2.php設計,并行blast檢驗,由Eurogentec合成。

1.2.2 細胞培養 HepG2細胞加入含10%FBS的DMEM培養基,37℃、5%CO2培養箱中培養傳代。1.2.3 EGFR siRNA轉染 采用不同轉染試劑進行轉染。初始細胞接種密度為 5×104/孔,EGFR siRNA終濃度為40 nM,于24孔板中轉染48 h及72 h,篩選作用最佳的試劑。然后,選擇不同劑量的最佳試劑、siRNA濃度以及正反向轉染進行測試。設置Mock對照組(加入siRNA稀釋液Opti-Mem,無轉染試劑及siRNA)及空白對照組(無任何其他試劑)。由于內參基因GAPDH在HepG2細胞中表達穩定[3,4],故選取靶向GAPDH siRNA為轉染陽性對照組,轉染后測定GAPDH mRNA敲除率。同時GAPDH對細胞生長增殖無影響,故轉染后測定細胞增殖情況,評估轉染試劑對細胞生長的影響。用CellTiter96 AQueous One Solution試劑盒檢測細胞存活率,用siGLO和TOX陽性試劑盒檢測轉染率。

1.2.4 EGFR mRNA檢測 采用實時定量RT-PCR技術。根據已知基因序列自行設計EGFR、GAPDH及β-actin引物。GAPDH為EGFR mRNA敲除實驗內參照;β-actin為GAPDH mRNA敲除實驗內參照。收集各組細胞,用ABIPRISM 6100 p repstation法抽提細胞總RNA,用ND-1000 NanoDrop檢測RNA質量及濃度。取總RNA各200 ng,加入到10μl的RT反應體系中進行逆轉錄反應。取2μl的cDNA進行PCR,觀察溶解曲線。所有實驗重復 3次。采用ΔΔCp法分析結果,其中ΔCp為每一樣本EGFR mRNA的Cp值與自身內參GAPDH mRNA Cp值的差值,即CpEGFR-CpGAPDH,ΔΔCp為siRNA組樣本的ΔCp與陰性對照組樣本的ΔCp的差值(ΔCpsiRNA組-ΔCp對照組)。EGFR基因敲除率=(1-1/2ΔΔCp) ×100%[5]。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。樣本均數比較用 t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同轉染試劑的EGFR基因敲除率 Lipofectamine 2000、siPORT Amine transfection、combiMAGnetofection在轉染72 h后EGFRmRNA敲除率均超過65%,其中combiMAGnetofection敲除率最高,見表1。

表1 7種轉染試劑平均EGFR m RNA敲除率比較(±s)

表1 7種轉染試劑平均EGFR m RNA敲除率比較(±s)

注：Mock對照加入相應siRNA稀釋液Opti-Mem,無轉染試劑及siRNA;空白對照僅為細胞。

試劑 基因敲除率(%) 48 h 72 h LipofectamineTM 2000 65±2 68±6 siPORT TM Amine Transfection Agent 53±2 69±2 ICAFectin TM 442 siRNA transfection reagent 47±2 57±1 N-TER TM Nanoparticle siRNA Transfection System 45±5 57±10 X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent 35±6 63±3 polyMagnetofection TM-100 42±2 62±2 combiMAGnetofection TM reagent-500 75±2 76±3 Mock對照 1±1 0±2空白對照 3±1 3±1

2.2 combiMAGnetofection的優化轉染條件 分別用0.5、1、2μl的combiMAGnetofection及8、40、200 nM的EGFR siRNA轉染72 h,結果顯示,2μl combiMAGnetofection及200 nM EGFR siRNA的組合對基因沉默效率最高(90%±1%),但正向轉染基因敲除率與同條件反向轉染的基因敲除率相近(P＞0.05),見表2。

2.3 細胞存活率及轉染率 用2μl combiMAGnetofection及200 nM轉染陽性對照GAPDH siRNA 48 h及72 h的基因沉默率為 90%±5%、93%±8%,細胞存活率為 95%±7%及 94%±8%,與轉染scrambled siRNA的細胞存活率相近(48 h為96% ±8%,72 h為95%±6%),證明該轉染方法細胞毒性小。使用該轉染條件,48 h轉染率 ＞87%,72 h轉染率＞95%。

表2 不同劑量combiM AGnetofection、不同濃度EGFR siRNA、正反向轉染EGFR m RNA敲除率比較

3 討論

siRNA轉染的方法眾多,但各有優缺點。磷酸鈣沉淀法將氯化鈣、RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合,形成不溶的磷酸鈣顆粒,該顆粒黏附到細胞膜并通過胞飲進入靶細胞的細胞質,顆粒的大小和質量對于轉染的成功至關重要,該方法重復性差,轉染效率低。電穿孔法的原理是通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子,因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞,一般成功的電穿孔過程都伴隨高水平的細胞毒性。顯微注射法使用微吸管吸取siRNA溶液,在顯微鏡下將siRNA注射進細胞核,轉染率高,對細胞無毒害,但技術要求高,操作繁瑣。逆轉錄病毒法轉染效率高,但構建病毒載體耗時長且價格昂貴,尤其不適合于有效片段的篩選實驗[1]。陽離子脂質體帶正電,可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面,容易透過細胞膜,在各種體外培養細胞的 RNA干擾實驗中得到了廣泛的應用[6],但仍有一定的細胞毒作用,而且轉染效率低 。Magnetofection方法在磁力的作用下進行siRNA轉染,還可與其他轉染方法結合使用,提高siRNA轉染效率[2]。本研究發現,Magnetofection聯合Lipofectamine2000,即combiMAGnetofection介導EGFR siRNA轉染肝癌HepG2細胞48 h及72 h,都獲得了比其他方法更高的基因敲除率,為siRNA轉染提供了新的介質選擇。

基因敲除率受轉染方法、轉染細胞狀態、siRNA濃度、轉染試劑的用量、轉染復合物的孵育時間、培養液中血清和抗生素含量等影響[1]。轉染試劑與siRNA過量可引起細胞形狀改變,細胞脫落,甚至死亡,直接影響RNAi的效率,故對轉染條件進行優化是成功的RNAi實驗的前提。本研究發現,combiMAGnetofection介導EGFR siRNA轉染肝癌HepG2細胞最佳的實驗條件是2μl combiMAGnetofection/200 nM siRNA/24孔板/72 h,EGFR mRNA敲除率達90%。由于EGFR本身對細胞增殖有影響,故本實驗使用陽性GAPDH siRNA來檢驗combiMAGnetofection轉染細胞的活力。結果顯示,在48 h及 72 h,細胞存活率分別為 95%±7%及 94% ±8%。說明combiMAGnetofection轉染對細胞損傷小,細胞毒性效應低。

反向轉染與正向轉染的區別是后者需在轉染前1 d接種細胞鋪板,培養24 h后再加轉染復合物;前者則是先加入轉染試劑和siRNA混合物在培養板上共同溫育數十分鐘,然后加入細胞鋪板培養,其優點是節約培養時間[7],對某些貼壁重疊生長的細胞,可使其完全接觸siRNA混合物,提高轉染率。但本實驗并未發現逆向轉染與正向轉染的差別。

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