胰島素樣生長因子-1對兔動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞凋亡的影響

劉福林,周玉娟,劉 莉,許金鵬

(1河北大學附屬醫院,河北保定 071000;2河北大學基礎醫學院)

胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是由70個氨基酸殘基構成的單鏈蛋白,編碼基因在人類定位于 12號染色體。IGF-1可與IGF-1受體(IGF-1R)及其結合蛋白(IGFBP)結合。IGF-1的作用受IGFBP、p13-kinase、蛋白激酶C、IL-1等多種活性因子的影響[1]。IGF-1具有細胞分化、增殖功能和胰島素樣代謝作用。在動脈粥樣硬化(AS)的發生發展中,IGF-1涉及到平滑肌細胞增殖遷移、脂質沉積、炎癥反應、血管再生及細胞外基質重組等。本研究觀察了IGF-1對兔動脈粥樣硬化血管壁平滑肌細胞(VSMC)凋亡的影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和飼料 健康日本大耳白兔共 24只,雌雄不限,體質量 2.5～3.8 kg。普通飼料配方為標準兔飼料,高脂飼料配方為標準兔飼料92.0%、膽固醇2.0%、花生油6.0%。

1.1.2 實驗藥物、試劑 IGF-1,辛伐他汀。總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒。TUNEL試劑盒,DAB試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將 24只日本大耳白兔分籠適應性喂養1周后隨機分為正常組、模型組、IGF-1組及陽性對照(辛伐他汀)組,各6只。

1.2.2 兔動脈粥樣硬化模型制作及取材 每日上午將高脂飼料喂給模型組、IGF-1組及辛伐他汀組白兔(2.5 mg/kg),正常組白兔喂給相應劑量的普通飼料。高脂飼料喂養 1周后,模型組、IGF-1組及辛伐他汀組行股動脈內膜剝脫術,剝脫腹主動脈、股動脈、骼動脈內皮;正常組家兔麻醉后切開皮膚,分離股動脈,結扎近端血管,不做內皮剝脫。模型組術后繼續給予高脂飼料,IGF-1組及辛伐他汀組術后分別給予高脂飼料加0.1 mg/ml的IGF-1因子0.1 ml腹腔注射、辛伐他汀懸濁液按2.5mg/kg(辛伐他汀片碾碎制成1 mg/ml的懸濁液)經胃管灌胃。正常組術后普通飼料喂養加等劑量生理鹽水灌胃。12周后實驗兔用25%烏拉坦4ml/kg經耳緣靜脈注射麻醉,沿正中線剪開,腹腔靜脈取血,離心分離血清, -20℃保存,用于血脂檢測。在相同部位取一段長約1 cm的腹主動脈,冷生理鹽水沖洗,15%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片后行凋亡細胞檢測。

1.2.3 血脂測定 用生化分析儀測定TC、TG、LDL、HDL。

1.2.4 血管壁凋亡細胞檢測 采用TUNEL法。石蠟包埋的切片預處理后,滴加50μl的Tunel反應混合溶液,在濕盒中37℃孵育60min后加入50μl轉化劑,37℃孵育30 min。PBS沖洗3次,加入50～100μl的DAB底物溶液,室溫孵育10 min,PBS沖洗 3次。蘇木素復染細胞核,封片,光鏡下分析圖像。在高倍視野下每張切片隨機選 5個視野,用Image-Pro Plus圖像分析系統,計算5個視野的Tunel陽性細胞數,計算陽性細胞百分比。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。多組間比較用單因素方差分析;兩組間比較,方差齊用LSD方法,方差不齊則用Dunnett T3方法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血脂檢測結果 各組血脂檢測結果比較見表1。

表1 各組血脂檢測結果比較(mm ol/L,±s)

表1 各組血脂檢測結果比較(mm ol/L,±s)

注：與模型組相比,＊P＜0.05;與辛伐他汀組相比,△P＜0.05

組別 TC TG HDL LDL正常組 5.52±3.28＊ 0.67±0.24＊△ 0.89±0.71＊△ 1.71±1.25＊△模型組 27.17±10.66△ 2.01±0.57 3.24±0.27 12.48±3.54△IGF-1組 26.11±2.70△ 1.05±0.37 3.32±0.01 14.20±1.81△辛伐他汀組 11.28±4.17＊ 1.48±0.33 2.38±0.63 5.65±1.88＊

2.2 凋亡細胞檢測結果 正常組、模型組、IGF-1組、辛伐他汀組的凋亡細胞分別為 0.148%± 0.095%、40.167%±8.931%、6.333%±4.546%、44.833%±12.687%;模型組與正常組及IGF-1組相比,P均＜0.05;辛伐他汀組與正常組及IGF-1組相比,P均＜0.05。

3 討論

研究[2]表明,生長激素、IGF-1軸對物質代謝起著重要的作用。IGF-1通過降低生長激素、升調胰島素受體等途徑增加臟器、組織對胰島素的敏感性,調節糖、脂代謝。人出生后隨年齡的增長,血清IGF-1水平緩慢升高,50歲以后,血清IGF-1水平有一個緩慢下降的趨勢。劉岳鴻等[3]研究發現,老年人生長激素、IGF-1軸的活性下降可以導致血糖、血脂的異常,可能是糖尿病、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病發生發展的原因之一。

在AS初期,血管平滑肌細胞過度增殖是AS形成的重要步驟。血管壁細胞數量增多、內膜增厚、管腔變窄,除了與VSMC過度增殖有關,還與其凋亡率下降導致的細胞累積、數量增多密切相關[4]。因此,在病變初期調節VSMC凋亡可能成為抗AS的途徑之一。他汀類藥物可以誘導VSMC凋亡,減輕早期AS后的內膜增厚,預防血管再狹窄。

在AS進展期及后期,VSMC凋亡是導致粥樣斑塊破裂引發心血管事件的首要原因。首先,大量的VSMC凋亡可導致基質Ⅰ型膠原的合成減少,使斑塊纖維帽變薄,造成斑塊不穩定,易發生破裂,引起嚴重的臨床并發癥[5]。其次,凋亡的 VSMC不易清除,殘余部分成為鈣化基質囊泡的主要來源,引起斑塊鈣化。另外,VSMC凋亡的早期磷酸烯醇丙酮酸鹽暴露于細胞表面,在凝血因子Ⅴ、Ⅶ的參與下,可作為血栓形成的底物激活血小板而引起血栓形成[6]。最后,VSMC凋亡可導致IL-1及IL-8釋放和單核細胞趨化蛋白-1上調,引起過多的巨噬細胞趨化,而殘余物質的清除未見增加,巨噬細胞產生的機體活性氧簇(ROS)及分泌的巨噬細胞—集落刺激因子和TNF-α又促進VSMC的凋亡,形成惡性循環[7]。IGF-1通過抑制VSMC凋亡來穩定粥樣斑塊,減少AS晚期炎癥、鈣化、血栓形成。

AS的高危因素如高脂血癥、高血壓、糖尿病及其并發癥等與 IGF-1表達密切相關。本研究發現, IGF-1對AS有一定的防治作用,并能在AS形成晚期維持斑塊穩定性,其機制可能與減少VSMC凋亡有關,為臨床上試用人重組IGF-1治療AS等相關疾病提供了理論依據。

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